Anvendelse af Fluorescens Total Intern Reflection Fluorescens Mikroskopi
TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescence Microscope), total intern refleksions fluorescensmikroskop, når lys kommer ind i et medium med et lavere brydningsindeks fra et medium med et højt brydningsindeks, hvis indfaldsvinklen er stor nok, reflekteres alt lyset uden brydning, men i Grænsefladen mellem de to medier producerer flygtige bølger, der kan excitere fluorescensen inden for 100 nm nær grænsefladen for at realisere observationen af objektets overflade. Excitationslyset kan sendes gennem illuminatoren på et konventionelt fluorescensmikroskop eller en speciel illuminator, og laserens indfaldsvinkel kan kontrolleres. Den øjeblikkelige feltexcitationsmetode bruges til at forhindre, at excitationslyset trænger ind i detektoren. Excitationslyset ved grænsefladen mellem glas og vand producerer en fuld intern implementeret ved refleksion. På grund af den eksponentielle dæmpning af excitationslyset vil kun prøveområdet meget tæt på den totale reflektionsoverflade producere fluorescensrefleksion, hvilket i høj grad reducerer interferensen af baggrundslys til observationsmålet, så denne teknologi er meget udbredt i den dynamiske observation af celleoverfladestoffer.
Skematisk diagram af total intern reflektionsfluorescensmikroskopi (TIRFM)
①Eksempel ②Evanescerende bølgeområde ③Dækglas ④Olienedsænkning ⑤Mål ⑥Emissionsstråle (signal) ⑦Excitationsstråle
For at opnå total intern refleksion kræves en stor indfaldsvinkel, f.eks. er indfaldsvinklen ved glas-vand-grænsefladen større end 61 grader. Dette kan opnås ved et prisme, kaldet prisme-baseret TIRFM, eller ved et objektiv med en høj numerisk blænde, som kaldes objektiv-type TIRFM. De nuværende kommercialiserede totalinterne reflektionsfluorescensmikroskoper er generelt af objektivlinsetypen med høj hastighed og høj præcision.
Total intern reflektionsfluorescensmikroskopi er meget udbredt inden for nogle biologiske områder, fordi den kan realisere fluorescensobservation i et meget tyndt område (mindre end 100 nm) på overfladen af objekter. Såsom følgende applikationer:
Observation af celleoverfladebilleder: cellemembranoverfladestruktur, celleoverfladekontakt, membranoverfladedynamik/proteinlokalisering.
Enkeltmolekyleobservation og -manipulation: myosin, actin og Cy3-mærket ATP.
Cellemembranoverfladebevægelse: såsom vesikelopslugning, vesikeludånding og vesikeleksokrin. det
Observation af calciumgnisterfænomen i cellemembran, ionkanalovervågning.
Molekylær motorisk forskning: rotationsmotorer, cytoskeletproteiner, polymerer, G-proteiner, ringproteiner, nukleotidmotorer.
Ud over biologiområdet har det også gode anvendelser inden for kemi til observation af kemiske molekylære strukturer.
