Grundlæggende struktur af konfokal fluorescensmikroskopi
(1) Scanningsmodul
Scanningsmodulet består hovedsageligt af en pinhole-lysstang (som kontrollerer tykkelsen af optiske skiver), et spektroskop (ændrer retningen af lysudbredelse i henhold til bølgelængde), et emissionsfluorescenskolorimeter (vælger lys inden for et bestemt bølgelængdeområde til detektion) og en detektor (fotomultiplikatorrør). Den blandede fluorescens i den fluorescerende prøve kommer ind i scanneren, og efter at være blevet valgt af detektionsnålehullets lysbjælke, spektrometer og kolorimeter, opdeles den i forskellige monokromatiske fluorescenser, som detekteres i forskellige fluorescenskanaler og danner tilsvarende konfokale billeder. Samtidig kan flere parallelle monokromatiske fluorescensbilleder og deres sammensatte billeder vises på computerskærmen.
(2) Fluorescensmikroskopisystem
Mikroskop er hovedkomponenten i LSCM, som er relateret til systemets billedkvalitet. Mikroskopets optiske vej kan nemt indsættes i et uendeligt fjernt optisk system med optiske muligheder uden at påvirke billedkvaliteten og målenøjagtigheden. Målet skal være et apokromatisk objektiv med stor numerisk apertur, fladt felt, hvilket er gavnligt for fluorescensoptagelse og klar billeddannelse. Konverteringen af objektivlinsegruppen, valg af farvefiltergruppen, bevægelsesjustering af scenen og hukommelseslåsning af brændplanet bør alt sammen styres automatisk af computeren.
Fluorescensmikroskopet, der bruges i laserscanningskonfokalmikroskopi, er generelt det samme som et konventionelt fluorescensmikroskop, men det har sine egne karakteristika: det skal forbindes til en scanner, så laseren kan komme ind i mikroskopobjektivet for at bestråle prøven og lave fluorescensen udsendt af prøven når detektoren; Der kræves en lysvejskonverteringsanordning, som omdanner kviksølvlamper til lasere, og kviksølvlampens lysintensitet kan justeres.
(3) Almindelige lasere
Laserkilderne, der bruges i laserscanningskonfokalmikroskopi, omfatter enkeltlaser- og multilasersystemer, og de almindeligt anvendte lasere omfatter følgende tre typer:
Halvlederlaser: 405nm (nær ultraviolet spektrallinje)
Argon ion laser: 457nm, 477nm, 488nm, 514nm (blåt grønt lys)
He-Ne laser: 543nm (grønt lys He-Ne grøn laser) 633nm (rødt lys He-Ne rød laser)
UV-laser (UV-laser): 351 nm, 364 nm (UV-lys)
(4) Hjælpeudstyr
Luftkølede, vandkølede kølesystemer og regulerede strømforsyninger.
Det grundlæggende arbejdsprincip for et laserscanningskonfokalmikroskop er først at udsende en vis bølgelængde af excitationslys fra laseren. Efter forstærkning passerer lyset gennem den oplyste pinhole-lysstang i scanneren for at danne en punktlyskilde. Objektivlinsen fokuserer på prøvens brændplan, og de tilsvarende belyste punkter på prøven exciteres og udsender fluorescens. Efter at have passeret gennem lysbjælken til detektionshullet, når den detektoren og afbildes på computerens overvågningsskærm. På denne måde dannes et komplet konfokalt billede af fluorescensbillederne af hvert punkt af prøven på brændplanet, som kaldes en lys skive.
