Sammenligning mellem konfokalmikroskop og almindeligt optisk mikroskop
Generelt optisk mikroskop
Det generelle biologiske mikroskop består af tre dele, nemlig: ① belysningssystem, inklusive lyskilde og kondensator; ② Optisk forstærkningssystem, som består af objektivlinse og okular, er hoveddelen af mikroskopet. For at eliminere sfærisk aberration og kromatisk aberration er både okularet og objektivlinsen sammensat af komplekse linsegrupper; (3) mekanisk anordning, der bruges til fastgørelse af materialer og praktisk observation.
Hvorvidt mikroskopbilledet er klart eller ej afhænger ikke kun af forstørrelsen, men også af mikroskopets opløsning. Opløsning refererer til mikroskopets evne (eller det sted, hvor menneskelige øjne er 25 cm væk fra målet) til at skelne mellem det lille interval af objektet zui. Opløsningen afhænger af lysets bølgelængde, blændeforholdet og mediets brydningsindeks, som udtrykkes ved formlen:
R=0.61λ /N．A. N．A．＝ｎsin /2
Hvor: n= brydningsindeks for medium;=spejlvinkel (prøvens åbningsvinkel i forhold til objektivets blænde) og NA= numerisk blænde. Spejlvinklen er altid mindre end 180? Derfor skal zui-værdien af sina/2 være mindre end 1.
Brydningsindekset for glasset, der bruges til fremstilling af optiske linser, er 1,65 ~ 1,78, og brydningsindekset for det anvendte medium er tættere på glasset, jo bedre. For den tørre objektivlinse er mediet luft, og blændeforholdet er generelt 0.05 ~ 0,95; Olielinsen bruger duftende asfalt som medium, og linsens åbningshastighed kan være tæt på 1,5.
Bølgelængden af almindeligt lys er 400~700nm, så opløsningen af mikroskop er ikke mindre end 0,2μm, og opløsningen af det menneskelige øje er 0,2mm, så den store forstørrelse af zui designet af generelt mikroskop er normalt 1000X x.
Hvorfor har du brug for et konfokalmikroskop?
1. Det optiske mikroskop er blevet perfektioneret gennem indsatsen og forbedringen af vores store forgængere. Faktisk kan almindelige mikroskoper give os smukke mikroskopiske billeder enkelt og hurtigt. Der skete imidlertid en begivenhed, der bragte revolutionerende innovation til denne næsten perfekte mikroskopverden, som er opfindelsen af "laser scanning konfokalmikroskop". Dette nye mikroskop er kendetegnet ved at anvende et optisk system, der kun udtrækker billedinformationen på det plan, hvor fokus er koncentreret, og genskaber den opnåede information i billedhukommelsen, mens fokus ændres, så et levende billede med fuldstændig tredimensionel information kan fås. Ved denne metode kan information om overfladeformen, som ikke kan bekræftes med almindelige mikroskoper, ganske enkelt opnås. For almindelige optiske mikroskoper er "forbedring af opløsningen" og "uddybning af fokusdybden" desuden modstridende forhold, især ved høj forstørrelse, men for konfokale mikroskoper er dette problem løst.
2. Fordele ved konfokalt optisk system
Konfokalt optisk system belyser prøvepunktet, og det reflekterede lys modtages også af punktreceptorer. Når prøven er placeret i fokuspositionen, kan næsten alt det reflekterede lys nå fotoreceptoren, men når prøven afviger fra fokus, kan det reflekterede lys ikke nå fotoreceptoren. Det vil sige, at i det konfokale optiske system vil kun det billede, der falder sammen med fokus, blive udsendt, og facula og ubrugeligt spredt lys vil blive afskærmet.
3. Hvorfor bruge en laser?
I det konfokale optiske system belyses prøven, og det reflekterede lys modtages også af en punktfotoreceptor. Derfor bliver punktlyskilde nødvendig. Laser hører til en meget punktlyskilde. I de fleste tilfælde anvender lyskilden til konfokalmikroskop laserlyskilde. Derudover er laserens egenskaber, såsom monokromaticitet, retningsbestemmelse og fremragende stråleform, også vigtige grunde til dens brede anvendelse.
4. Realtidsobservation baseret på højhastighedsscanning bliver mulig.
I laserscanningen bruges den akustiske optiske deflektor (AO prime element) i vandret retning og Servo Galvano-spejlet i lodret retning. Fordi der ikke er nogen mekanisk vibrationsdel i den akustiske optiske afbøjningsenhed, kan den scanne ved høj hastighed, og det er muligt at observere i realtid på overvågningsskærmen. Den høje hastighed af dette kamera er et meget vigtigt projekt, der direkte påvirker hastigheden af fokusering og positionssøgning.
5. Sammenhæng mellem fokusposition og lysstyrke
I det konfokale optiske system, når prøven er korrekt placeret i fokuspositionen, er lysstyrken stor, og før og efter den, vil dens lysstyrke falde kraftigt (utrukket linje i figur 4). Denne følsomme selektivitet af brændplanet er også princippet om at måle højderetningen af konfokalmikroskop og udvide brændvidden. I modsætning hertil har det almindelige optiske mikroskop ikke tydelige lysstyrkeændringer før og efter fokuspositionen (stiplet linje i figur 4).
6. Høj kontrast og høj opløsning
I almindeligt optisk mikroskop vil det reflekterede lys, der afviger fra fokus, interferere, og det vil overlappe med fokus-billeddannelsesdelen og dermed reducere billedkontrasten. I modsætning hertil er det spredte lys uden for fokus og det spredte lys inde i objektivlinsen næsten helt fjernet i det konfokale optiske system, så der kan opnås et billede med meget høj kontrast. Fordi lyset passerer gennem objektivlinsen to gange, skærpes punktbilledet desuden først, og mikroskopets opløsning forbedres også.
7. Optisk lokaliseringsfunktion
I det konfokale optiske system er det reflekterede lys fra den anden del end brændpunktet afskærmet af mikroporer. Derfor, når man observerer en tredimensionel prøve, dannes et billede som det, der dannes efter udskæring af prøven med fokus (figur 5). Denne effekt kaldes optisk lokalisering, som hører til en af specialiteterne i konfokalt optisk system.
8. Fokus flytte hukommelse funktion
Det såkaldte reflekterede lys uden for fokus er afskærmet af mikroporerne. På den anden side kan det anses for, at alle punkter på billedet dannet af det konfokale optiske system falder sammen med fokus. Derfor, hvis den tredimensionelle prøve flyttes langs Z-aksens (optisk akse) retning, vil billedet blive akkumuleret og lagret i hukommelsen, og zui vil til sidst få billedet dannet af sammenfaldet af hele prøven og fokus . På denne måde kaldes funktionen for uendelig fokuseringsdybde mobilhukommelsesfunktion.
9. Funktion til måling af overfladeform
I fokusbevægelsesfunktionen kan overfladeformen af prøven måles på en ikke-kontakt måde ved at tilføje en højderegistreringsløkke. Baseret på denne funktion er det muligt at registrere Z-aksens koordinater dannet af den store lysstyrkeværdi af zui i hver pixel, og baseret på denne information kan informationen relateret til prøvens overfladeform opnås.
10. Funktion til måling af mikrostørrelse med høj præcision
Den lysmodtagende enhed anvender en endimensionel CCD-billedsensor, så den kan være upåvirket af scanningshældningen af scanningsenheden, så højpræcisionsmåling kan fuldføres. Fordi hukommelsesfunktionen til fokusbevægelse med justerbar fokusdybde samtidig anvendes, kan målefejlen forårsaget af fokusforskydning elimineres.
11. Tredimensionel billedanalyse
Ved at bruge overfladeformmålingsfunktionen kan det tredimensionelle billede af prøveoverfladen nemt laves. Ikke kun det, men også mange slags analyser kan udføres, såsom: overfladeruhedsmåling, areal, volumen, overfladeareal, cirkularitet, radius, længde af zui, omkreds, tyngdepunkt, tomografisk billede, FFT-transformation, linje breddemåling og så videre.
Laser konfokalt scanningsmikroskop kan bruges ikke kun til at observere cellemorfologi, men også til kvantitativ analyse af biokemiske komponenter i celler, optisk tæthedsstatistik og cellemorfologimåling.
