Bestemmelse af antallet af mikroorganismer - mikroskopets direkte tællemetode!
Bakteriepopulationsvækst manifesteres ved en stigning i celleantal eller en stigning i cellulær masse. Metoderne til bestemmelse af antallet af celler omfatter direkte mikroskoptællingsmetode, pladekolonitællingsmetode, fotoelektrisk olieforholdsmetode, maksimal sandsynlighedsmetode og membranfiltreringsmetode. Metoderne til måling af cellestof omfatter bestemmelse af celletørvægt, bestemmelse af visse cellulære komponenter såsom nitrogen-, RNA- og DNA-indhold og bestemmelse af metabolitter. Kort sagt er der mange metoder til at måle væksten af mikroorganismer med hver deres fordele og ulemper, og de bør udvælges efter den konkrete situation. Dette eksperiment introducerer hovedsageligt mikroskopets direkte tællemetode, der almindeligvis anvendes i produktion og videnskabelig forskning.
1. Formålskrav
1. Klargør princippet om blodcelletælling.
2. Mestre metoden til at tælle mikroorganismer ved hjælp af en blodcelletæller.
2. Grundlæggende principper
Mikroskop direkte tællemetode er en enkel, hurtig og intuitiv metode til direkte at tælle en lille mængde suspension af prøven, der skal testes på et specielt objektglas med et bestemt areal og volumen (også kendt som en bakterietæller). Metoder. På nuværende tidspunkt er de almindeligt anvendte bakterietællere i ind- og udland: blodcelletæller, Peteroff-Hauser bakterietæller og Hawksley bakterietæller osv. De kan bruges til tælling af gær, bakterier, skimmelsporer og andre suspensioner, og grundprincippet er det samme. De to sidstnævnte typer bakterietællere har et samlet volumen på 0.02 mm3 efter at være blevet dækket med et dækglas, og afstanden mellem dækglas og objektglas er kun 0,02 mm, så olien nedsænkningsobjektivlinse kan bruges til at observere og observere små celler såsom bakterier. tælle. Ud over disse bakteriometre findes der også en estimeringsmetode for forholdet mellem arealet af udstrygningen og arealet af synsfeltet observeret direkte under mikroskopet, som almindeligvis anvendes til bakteriologisk undersøgelse af mælk. Fordelene ved mikroskopets direkte tællemetode er intuitiv, hurtig og nem at betjene. Ulempen ved denne metode er dog, at det målte resultat normalt er summen af døde og levende celler. På nuværende tidspunkt er der nogle metoder til at overvinde denne mangel, såsom kombinationen af levedygtige bakterier, der farver mikrokammerkultur (kort tid) og tilføjelse af celledelingshæmmere for at opnå formålet med kun at tælle levedygtige bakterier.
I dette eksperiment blev et hæmocytometer brugt som eksempel til direkte mikroskopisk tælling. For brugen af de to andre typer bakterietællere henvises til instruktionerne fra hver producent. Tælling direkte under mikroskopet med et hæmocytometer er en almindeligt anvendt metode til at tælle mikroorganismer. Tællepladen er en speciel glasrute, hvorpå tre platforme er dannet af fire slidser; den bredere platform i midten er delt i to halvdele af en kort tværgående spalte, og der er et gitter på hver side af platformen. Hvert gitter er opdelt i ni store firkanter, og den store firkant i midten er tællerummet. Strukturen af blodlegemetællepladen er vist i figur l{{{{10}}}}. Målerummets målestok har generelt to specifikationer, den ene er en stor firkant opdelt i 25 midterste firkanter, og hver midterste firkant er opdelt i 16 små firkanter (Figur 15-2); den anden er en stor firkant. Firkanten er opdelt i 16 midterste firkanter, og hver midterste firkant er opdelt i 25 små felter, men uanset hvilken slags tællebræt det er, er der 400 små felter i hver stor firkant. Sidelængden af hver stor firkant er 1 mm, og arealet af hver stor firkant er 1 mm2. Efter afdækning med et dækglas er højden mellem dækglas og objektglas 0,1 mm, så tællekammerets volumen er 0,1 mm3 (en tusindedel af en milliliter). Figur 15-1 Strukturen af blodcelle-tællepladen (1) Figur 15-2 Strukturen af blodcelle-tællepladen (2) A. Set forfra; B. Længdesnit; Det forstørrede gitter, den store firkant i midten er tællekammeret 1. Blodceller Tælleplade; 2. Dækglas; 3. Når du tæller i tællekammeret, tæller du normalt det samlede antal bakterier i fem kvadrater, beregner derefter gennemsnittet af hver kvadrat, og ganges med 25 eller 16 for at få Det samlede antal bakterier i et stort kvadrat omregnes derefter til det samlede antal bakterier i 1 ml bakterieopløsning. Lad det samlede antal bakterier i de fem kvadrater være A, og fortyndingsforholdet for bakterieopløsningen til at være B. Hvis det er en tælleplade med 25 kvadrater, er det samlede antal bakterier i 1 mL bakterieopløsning {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(stykker) På samme måde, hvis det er en tælleplade med 16 mellemstore kvadrater, er det samlede antal bakterier i 1mL bakterieopløsning=A/ 5×16×104×B=32000A·B (stykker)
3. Udstyr
1. Bakterier
Saccharomyces cerevisiae
2. Instrumenter eller andre redskaber
Hæmocytometer, mikroskop, dækglas, steril kapillarpiper.
4. Betjeningstrin
1. Fremstilling af bakteriesuspension
Saccharomyces cerevisiae blev fremstillet til en bakteriesuspension af passende koncentration med sterilt fysiologisk saltvand.
2. Mikroskoptællerum
Før du tilføjer prøver, skal du mikroskopisk inspicere tællekammeret på tællepladen. Hvis der er snavs, skal det renses og tørres inden optælling.
3. Tilføj prøve
Dæk det rene og tørre hæmocytometer med et dækglas, og brug derefter en steril kapillarpiper til at droppe en lille dråbe af den rystede Saccharomyces cerevisiae suspension fra kanten af dækglasset, og lad bakterieopløsningen automatisk bevæge sig langs mellemrummet ved kapillær osmose. Ind i tællerummet kan det generelle tællerum fyldes med bakterievæske. Ved prøvetagning rystes først bakterieopløsningen; ved tilsætning af prøver bør der ikke dannes luftbobler i tællekammeret.
4. Mikroskoptælling
Efter tilsætning af prøven, stå stille i 5 minutter, placer derefter hæmocytometeret på mikroskopet, find først placeringen af tællekammeret med et laveffektmikroskop, og skift derefter til et højeffektmikroskop til tælling. Juster intensiteten af mikroskoplyset passende. For mikroskoper, der bruger spejle til belysning, skal du være opmærksom på ikke at afvige fra den ene side af lyset, ellers vil det ikke være let at se tællerummets firkantede linjer tydeligt i synsfeltet, eller kun lodrette linjer eller vandrette linjer vil blive set. Hvis det konstateres, at bakterieopløsningen er for koncentreret eller for fortyndet før tælling, er det nødvendigt at justere fortyndingen før tælling. Generelt kræver prøvefortyndingen omkring 5 til 10 bakterier i hver lille celle. Hvert tællekammer vælger 5 midterste celler (valgfrit 4 hjørner og en midterste celle i midten) til optælling. Cellerne placeret på gitterlinjen tælles generelt kun på de øverste og højre linjer. I tilfælde af gærknopper, når størrelsen af knoppen når halvdelen af modercellen, tælles det som to bakterieceller. For at tælle en prøve skal du beregne bakterieindholdet i prøven ved at beregne gennemsnitsværdien fra de to tællekamre.
5. Vask blodcelletallet
Efter brug skylles blodlegemetællerpladen med vand i hanen, skrub ikke med hårde genstande, og tør den selv eller med en hårtørrer efter vask. Mikroskopisk undersøgelse for at observere, om der er tilbageværende bakterier eller andre sedimenter i hver lille celle. Hvis det ikke er rent, skal det vaskes gentagne gange, indtil det er rent.
