Forskellen mellem fluorescensmikroskop og normalt mikroskop
1. Se på belysningsmetoden
Belysningsmetoden for fluorescensmikroskop er generelt epi-type, det vil sige, at lyskilden placeres på testprøven gennem objektivlinsen.
2. Se på opløsningen
Fluorescensmikroskoper bruger ultraviolet lys som lyskilde, med en relativt kort bølgelængde, men opløsningen er højere end for almindelige optiske mikroskoper.
3, forskellen i filteret
Fluorescensmikroskop bruger to specielle filtre, der bruges foran lyskilden til at filtrere synligt lys fra, og bruges mellem objektivlinsen og okularet til at filtrere ultraviolet lys fra, som kan beskytte menneskelige øjne.
Fluorescensmikroskop er også en type optisk mikroskop, primært fordi bølgelængden exciteret af fluorescensmikroskopet er kort, så dette fører til forskellen i strukturen og brugen af fluorescensmikroskopet og det almindelige mikroskop. De fleste af fluorescensmikroskoperne har en god funktion til at fange svagt lys. , så under ekstremt svag fluorescens er dens billeddannelsesevne også god. Sammen med den løbende forbedring af fluorescensmikroskopi i de senere år er støj også blevet kraftigt reduceret. Derfor bruges flere og flere fluorescensmikroskoper.
Kendskab til Two-Photon Fluorescence Microscopy
Grundprincippet for to-foton excitation er: i tilfælde af høj fotondensitet kan fluorescerende molekyler absorbere to langbølgede fotoner på samme tid, og efter en meget kort såkaldt exciteret tilstands levetid udsende en kortbølgelængde foton ; effekten er den samme som at bruge en foton med en bølgelængde, der er halvdelen af den lange bølgelængde til at excitere et fluorescerende molekyle. To-foton excitation kræver høj foton tæthed, og for ikke at beskadige celler, to-foton mikroskopi bruger højenergi mode-låste pulserende lasere. Denne laser udsender laserlys med høj spidsenergi og lav gennemsnitsenergi med en pulsbredde på kun 100 femtosekunder og en frekvens på 80 til 100 MHz. Når en objektivlinse med høj numerisk blænde anvendes til at fokusere fotonerne i den pulserende laser, er fotondensiteten ved objektivlinsens brændpunkt den højeste, og excitationen af to foton sker kun ved objektivlinsens brændpunkt, så to-foton-mikroskopet behøver ikke et konfokalt nålehul, hvilket forbedrer effektiviteten af fluorescensdetektion.
I det generelle fluorescensfænomen kan et fluorescerende molekyle på grund af excitationslysets lave fotondensitet kun absorbere én foton på samme tid og derefter udsende en fluorescerende foton gennem strålingsovergangen, som kaldes single-photon fluorescens. Til fluorescensexcitationsprocessen med laser som lyskilde kan to-foton eller endda multi-foton fluorescens fænomen forekomme. På dette tidspunkt er intensiteten af den anvendte excitationslyskilde høj, og fotondensiteten opfylder kravet om, at det fluorescerende molekyle absorberer to fotoner på samme tid. I processen med at bruge en generel laser som excitationslyskilde er fotondensiteten stadig ikke nok til at producere to-fotonabsorption. Normalt bruges en femtosekund pulseret laser, og dens øjeblikkelige effekt kan nå størrelsesordenen megawatt. Derfor er bølgelængden af to-foton-fluorescensen kortere end bølgelængden af excitationslyset, hvilket svarer til den effekt, der frembringes af halv-excitationsbølgelængde-excitationen.
To-foton fluorescensmikroskopi har mange fordele:
1) Lys med lang bølgelængde påvirkes mindre af spredning end lys med kort bølgelængde og kan let trænge igennem prøven;
2) De fluorescerende molekyler uden for brændplanet exciteres ikke, således at mere excitationslys kan nå brændplanet, så excitationslyset kan trænge dybere prøver igennem;
3) Nær-infrarødt lys med lang bølgelængde er mindre giftigt for celler end lys med kort bølgelængde;
4) Ved visning af prøver med to-fotonmikroskopi er fotoblegning og fototoksicitet kun til stede i fokalplanet. Derfor er to-fotonmikroskopi mere velegnet til at se tykke prøver end enkeltfotonmikroskopi, til at se levende celler eller til at udføre fikspunktsfotoblegningseksperimenter.
Kendskab til konfokal fluorescensmikroskopi
Det grundlæggende princip for konfokal fluorescensmikroskopi: Ved at bruge en punktlyskilde til at belyse prøven dannes en lille lysplet med en veldefineret kontur på brændplanet. består af stråledeleren. Strålesplitteren sender fluorescensen direkte til detektoren. Der er et nålehul foran lyskilden og detektoren, henholdsvis kaldet belysningsnålhullet og detektionsnålehullet. De geometriske dimensioner af de to er de samme, ca. 100-200 nm; i forhold til lyspletten på brændplanet, er de to konjugerede, det vil sige, at lyspletten passerer gennem en række linser og til sidst kan fokuseres på belysningsnålehullet og detektionsnålehullet på samme tid. På denne måde kan lyset fra brændplanet koncentreres inden for detektionshullets rækkevidde, mens det spredte lys fra over eller under brændplanet blokeres ud af detektionshullet og ikke kan afbildes. Prøven scannes punkt for punkt med laseren, og fotomultiplikatorrøret opnår efter detektering af pinhole også det konfokale billede af det tilsvarende lys punkt for punkt, som konverteres til et digitalt signal og transmitteres til computeren og til sidst aggregeres på skærmen til et klart konfokalt billede af hele brændplanet. .
Hvert brændplansbillede er faktisk et optisk tværsnit af prøven, og dette optiske tværsnit har altid en vis tykkelse, også kendt som en optisk skive. Da lysintensiteten ved brændpunktet er meget større end i ikke-brændpunktet, og lyset i ikke-brændplanet filtreres ud af nålehullet, er dybdeskarpheden af det konfokale system omtrentlig nul, og scanning langs Z-aksen kan realisere optisk tomografi, der danner Observer en todimensional optisk sektion på det fokuserede sted af prøven. Ved at kombinere XY-plan (brændplan) scanning med Z-akse (optisk akse) scanning, ved at akkumulere todimensionelle billeder af på hinanden følgende lag og behandling med speciel computersoftware, kan et tredimensionelt billede af prøven opnås.
Det vil sige, at detektionsnålehullet og lyskildenålhullet altid er fokuseret på det samme punkt, således at fluorescensen exciteret uden for fokuseringsplanet ikke kan trænge ind i detektionsnålhullet.
Det enkle udtryk for arbejdsprincippet for konfokal laser er, at den anvender en laser som lyskilde, og på basis af traditionel fluorescensmikroskop-billeddannelse er en laserscanningsenhed og en konjugeret fokuseringsenhed fastgjort, og den digitale billedoptagelse og -behandling systemet styres af en computer.
