Forskellen mellem almindeligt mikroskop og fluorescensmikroskop
Fluorescensmikroskoper bruger ultraviolet lys som lyskilde til at bestråle det objekt, der skal inspiceres, så objektet udsender lys, og observer derefter objektet under mikroskopet. Det bruges hovedsageligt til immunfluorescensceller. Det er hovedsageligt sammensat af en lyskilde, et filterpladesystem og et optisk system til at observere det fluorescerende billede af prøven gennem forstørrelsen af okularet og objektivlinsen. Lad os tage et kig på forskellen mellem dette fluorescensmikroskop og et almindeligt optisk mikroskop.
1. Med hensyn til belysningsmetoder
Fluorescensmikroskopets belysningsmetode er generelt episkopisk, det vil sige, at lyskilden projiceres på testprøven gennem objektivlinsen.
2. Med hensyn til opløsning
Fluorescensmikroskoper bruger ultraviolet lys som lyskilde. Bølgelængden er relativt kort, men opløsningen er højere end for almindelige optiske mikroskoper.
3. Forskellen i filteret
Fluorescensmikroskopet bruger to specielle filtre, som bruges foran lyskilden til at filtrere synligt lys fra, og som bruges mellem objektivlinsen og okularet til at filtrere ultraviolet lys fra, som kan beskytte menneskelige øjne.
Fluorescensmikroskop er også en slags optisk mikroskop, primært fordi bølgelængden exciteret af fluorescensmikroskop er kort, så dette fører til forskellen i struktur og anvendelse mellem fluorescensmikroskop og almindeligt mikroskop. De fleste fluorescensmikroskoper har en god funktion til at fange svagt lys, så under ekstremt svag fluorescens er dets billeddannelsesevne også god. Sammen med den løbende forbedring af fluorescensmikroskoper i de senere år er støjen også blevet kraftigt reduceret. Derfor bruges flere og flere fluorescensmikroskoper.
Viden om to-foton fluorescensmikroskopi
Grundprincippet for to-foton excitation er: i tilfælde af høj foton tæthed kan fluorescerende molekyler absorbere to langbølgelængde fotoner på samme tid og udsende en kortere bølgelængde foton efter en kort periode med såkaldt exciteret tilstand levetid . ; effekten er den samme som at bruge en foton, hvis bølgelængde er halvdelen af den lange bølgelængde til at excitere et fluorescerende molekyle. To-foton excitation kræver en høj foton tæthed. For ikke at beskadige celler bruger to-fotonmikroskopi højenergi-moduslåste pulserende lasere. Laseren, der udsendes af denne laser, har høj spidsenergi og lav gennemsnitsenergi, dens pulsbredde er kun 100 femtosekunder, og dens frekvens kan nå 80 til 100 megahertz. Når du bruger en objektivlinse med høj numerisk blænde til at fokusere fotonerne i den pulserende laser, er fotondensiteten ved objektivlinsens brændpunkt den højeste, og excitationen af to fotoner sker kun ved objektivlinsens brændpunkt, så to-foton-mikroskopet behøver ikke et konfokalt nålehul, hvilket forbedrer effektiviteten af fluorescensdetektion.
I almindelige fluorescensfænomener kan et fluorescerende molekyle på grund af excitationslysets lave fotondensitet kun absorbere én foton på samme tid og derefter udsende en fluorescerende foton gennem en strålingsovergang, som er enkeltfotonfluorescens. Til fluorescensexcitationsprocessen, der anvender laser som lyskilde, kan to-foton eller endda multi-foton fluorescens forekomme. På dette tidspunkt er intensiteten af den anvendte excitationslyskilde høj, og fotondensiteten opfylder kravene til fluorescerende molekyler, der absorberer to fotoner på samme tid. I processen med at bruge en generel laser som excitationslyskilde er fotondensiteten stadig ikke nok til at producere to-fotonabsorptionsfænomenet. Normalt bruges en femtosekund pulseret laser, og dens øjeblikkelige effekt kan nå størrelsesordenen megawatt. Derfor er bølgelængden af to-foton fluorescens kortere end bølgelængden af excitationslys, hvilket svarer til den effekt, der frembringes af excitation ved halvdelen af excitationsbølgelængden.
To-foton fluorescensmikroskopi har mange fordele:
1) Lys med lang bølgelængde påvirkes mindre af spredning end lys med kort bølgelængde og trænger let igennem prøven;
2) De fluorescerende molekyler uden for brændplanet exciteres ikke, således at mere excitationslys kan nå brændplanet, så excitationslyset kan trænge dybere prøver igennem;
3) Langbølget nær-infrarødt lys er mindre giftigt for celler end lys med kort bølgelængde;
4) Når man bruger et to-fotonmikroskop til at observere prøver, forekommer fotoblegning og fototoksicitet kun i fokalplanet. Derfor er to-fotonmikroskopi mere egnet end enkeltfotonmikroskopi til observation af tykke prøver, til observation af levende celler eller til pletfotoblegningseksperimenter.
Viden om konfokal fluorescensmikroskopi
Det grundlæggende princip for konfokal fluorescensmikroskopi: en punktlyskilde bruges til at bestråle prøven, og en veldefineret lille lysplet dannes på brændplanet. sammensat af splittere. Strålesplitteren sender fluorescensen direkte til detektoren. Der er et nålehul foran lyskilden og detektoren, henholdsvis kaldet belysningsnålhullet og detektionsnålehullet. Den geometriske størrelse af de to er den samme, ca. 100-200nm; i forhold til lyspletten på brændplanet, er de to konjugerede, det vil sige, at lyspletten passerer gennem en række linser og til sidst kan fokuseres på belysningsnålehullet og detektionsnålehullet på samme tid. På denne måde kan lyset fra brændplanet konvergeres inden for detektionshullets omfang, mens det spredte lys fra oven eller under brændplanet blokeres uden for detektionshullet og ikke kan afbildes. Laseren scanner prøven punkt for punkt, og fotomultiplikatorrøret efter detektering af nålehullet opnår også det konfokale billede af det tilsvarende lys punkt for punkt, som omdannes til et digitalt signal og transmitteres til computeren og til sidst aggregeres til en klar konfokalt billede af hele brændplanet på skærmen.
Hvert brændplansbillede er faktisk et optisk tværsnit af prøven. Dette optiske tværsnit har altid en vis tykkelse, også kendt som et optisk tyndt snit. Da lysintensiteten ved brændpunktet er meget større end i ikke-fokuspunktet, og lyset i ikke-fokusplanet filtreres af nålehullet, er dybdeskarpheden af det konfokale system omtrentlig nul, og scanning langs Z -akse kan realisere optisk tomografi, der danner en Observer den todimensionelle optiske sektion på det fokuserede sted af prøven. Ved at kombinere XY-plan (brændplan) scanning med Z-akse (optisk akse) scanning, kan det tredimensionelle billede af prøven opnås ved at akkumulere todimensionelle billeder af kontinuerlige lag og behandles af speciel computersoftware.
Det vil sige, at detektionsnålehullet og lyskildenålhullet altid er fokuseret på det samme punkt, således at fluorescensen exciteret uden for brændplanet ikke kan trænge ind i detektionsnålehullet.
Det enkle udtryk for arbejdsprincippet for laserkonfokal er, at den bruger laser som lyskilde og på basis af traditionel fluorescensmikroskop-billeddannelse tilføjer en laserscanningsenhed og en konjugeret fokuseringsenhed, og er et system til digital billedoptagelse og behandling gennem computerstyring.
