Forskelle og karakteristika mellem fluorescensmikroskop og almindeligt optisk mikroskop
Fluorescensmikroskop er anderledes end almindeligt optisk mikroskop. Den observerer ikke prøven gennem belysning af en almindelig lyskilde. I stedet bruger den lys af en bestemt bølgelængde (normalt ultraviolet lys, blåviolet lys) til at excitere det fluorescerende materiale i prøven under mikroskopet, hvilket får det til at udsende fluorescens. Derfor tjener lyskilden i et fluorescensmikroskop ikke som direkte belysning, men som en energikilde, der exciterer det interne fluorescerende materiale i prøven. Grunden til, at vi kan observere prøven, skyldes ikke belysningen af lyskilden, men fluorescensfænomenet forårsaget af, at det fluorescerende materiale i prøven absorberer den exciterede lysenergi. Det kan ses, at hovedkarakteristikken ved et fluorescensmikroskop er, at dets lyskilde kan levere en stor mængde excitationslys i et bestemt bølgelængdeområde, således at de fluorescerende stoffer i den prøve, der undersøges, kan opnå den nødvendige intensitet af excitationslys. Samtidig skal fluorescensmikroskoper have tilsvarende filtersystemer. Fluorescensmikroskopi er et vigtigt værktøj til avanceret fluorescenshistokemi. Den er sammensat af ultrahøjtrykslyskilde, filtersystem (inklusive excitations- og undertrykkelsesfilterplader), optisk system og fotografisystem. Den bruger lys af en bestemt bølgelængde til at excitere prøven til at udsende fluorescens.
1. Måder at excitere fluorescens: Ifølge lysets bølgelængdeområde er det opdelt i to typer: UV-excitationsmetode (ved hjælp af ultraviolet belysningsmetode) og BV-excitationsmetode (ved hjælp af blåviolet lys). UV-excitationsmetoden bruger nær-ultraviolet lys kortere end 400nm til excitation. Der er intet synligt excitationslys i denne metode, så den observerede fluorescens viser farvestoffets iboende fluorescens, hvilket gør det let at skelne den specifikke fluorescens på prøven fra autofluorescensen i baggrundsvævet.
2. BV excitationsmetode: excitation fra ultraviolet til blåt lys centreret ved 404nm og 434nm. Denne metode bruger blåt lys til at belyse prøven, så afskæringsfilteret i fluorescensobservationssystemet skal bruge et filter, der fuldstændigt kan blokere blåt lys og fuldt ud passere den nødvendige grønne og gule fluorescens. Fluorescerende farvestoffer anvendt i fluorescerende antistofmetoder. Den maksimale absorptionsbølgelængde for excitationslys og den maksimale emissionsbølgelængde for fluorescens er relativt tæt på hinanden, så filteret, der anvendes i BV-excitationsmetoden, skal bruge et skarpt afskæringsfilter. Denne metode kan bruge blåt lys som excitationslys, så absorptionseffektiviteten af fluorescerende pigmenter er højere og lysere billeder kan opnås. Ulempen er, at fluorescens under 500nm ikke kan ses, mens fluorescens over 500nm får hele billedet til at se gult ud. I den fluorescerende antistofmetode bedømmes specificiteten af det fluorescerende farvestof for det meste ud fra dets unikke farve. Når man diskuterer den subtile specificitet, har de ovennævnte mangler ved BV-excitationsmetoden derfor ofte stor indflydelse.
