Direkte optælling af mikroorganismer med mikroskop
Eksperimentelt princip
Direkte tælling under et mikroskop ved hjælp af et hæmocytometer er en almindeligt anvendt mikrobiel tællemetode. Fordelen ved denne metode er, at den er intuitiv og hurtig. Anbring den passende fortyndede bakteriesuspension (eller sporesuspension) i tællekammeret mellem objektglasset og dækglasset på hæmocytometeret, og tæl under mikroskopet. Da volumenet af tællekammeret er fast (0.1 mm2), kan det konverteres til det samlede antal mikroorganismer pr. volumenenhed i henhold til antallet af mikroorganismer observeret under mikroskopet. Fordi denne metode tæller summen af levende og døde bakterier, kaldes den også for den samlede bakterietællingsmetode.
Et hæmocytometer er normalt en speciel glasplade, hvor fire riller danner tre platforme. Platformen i midten er delt i to halvdele af en kort vandret rille. Et gitter er indgraveret på platformen på hver side. Hvert gitter er opdelt i ni store firkanter. Den store firkant i midten er tællesalen. Mikroorganismer tælles i tællekammeret. Strukturen af blodcelle-tællepladen er vist i figur Ⅷ-1.
Målerummets skala har generelt to specifikationer, den ene er, at en stor firkant er opdelt i 16 midterste firkanter, og hver midterste firkant er opdelt i 25 små firkanter (Figur Ⅷ-2); den anden er en stor firkant. Firkanten er opdelt i 25 midterste firkanter, og hver midterste firkant er opdelt i 16 små firkanter (Figur Ⅷ-1, C). Men uanset hvilken slags tællebræt det er, er antallet af små firkanter i hver stor firkant det samme, det vil sige 16×25=400 små firkanter, som vist i figur Ⅷ-2.
Sidelængden af hver stor firkant er 1 mm, og arealet af hver stor firkant er 1 mm2. Efter dækglasset er dækket, er højden mellem dækglasset og dækglasset 0,1 mm, så volumenet af tællekammeret er 0,1 mm3.
Når du tæller, skal du normalt tælle det samlede antal bakterier i de fem midterste gitter, derefter opnå gennemsnitsværdien af hvert midterste gitter, og derefter gange med 16 eller 25 for at få det samlede antal bakterier i et stort gitter, og derefter konverteret til totalt antal bakterier i 1 ml bakterieopløsning.
Laboratorieudstyr
Hæmocytometer, mikroskop, dækglas, steril kapillær;
Eksperimentelle materialer
Saccharomyces cerevisiae suspension
Eksperimentel procedure (mikrobielt mikroskop direkte tællemetode)
1. fortynding
Fortynd Saccharomyces cerevisiae suspensionen korrekt. Hvis bakterieopløsningen ikke er tyk, skal den ikke fortyndes.
2. Mikroskopisk tællerum
Før du tilføjer prøver, skal du udføre en mikroskopisk inspektion af tællekammeret på tællepladen. Hvis der er snavs, skal det renses, inden der tælles.
3. tilføj prøve
Dæk den rene og tørre hæmocytometerplade med et dækglas, og brug derefter en steril dråbe med fin mund til at droppe en lille dråbe af den fortyndede Saccharomyces cerevisiae-opløsning fra kanten af dækglasset (ikke for meget), så bakterieopløsningen er tæt på mellemrummet langs mellemrummet. Kapillær osmose kommer af sig selv ind i tællekammeret, og det generelle tællekammer kan fyldes med bakterievæske. Pas på ikke at have luftbobler.
4. mikroskoptælling
Efter at have hvilet i 5 minutter, placer hæmocytometeret på mikroskopets scene, brug først en laveffektlinse til at finde placeringen af tællekammeret, og skift derefter til en højeffektlinse til tælling. Hvis det konstateres, at bakterieopløsningen er for tyk eller for tynd før tælling, er det nødvendigt at justere fortyndingen igen før tælling. Generelt kræver prøvefortyndingen ca. 5-10 bakterier i hver celle. Hvert tællekammer udvælger bakterierne i 5 midterste gitre (valgfrit 4 hjørner og centrale gitre) til optælling. Bakterierne på gitterlinjen tælles generelt kun på den øverste og højre linje. I tilfælde af gærknopper, når knopkroppens størrelse når halvdelen af modercellen, skal du tælle to bakterier. Tæl en prøve for at beregne bakterieindholdet i prøven ud fra de talte værdier i de to tællekamre.
5. Rengøring af hæmocytometeret
Efter brug skylles blodlegemetællerpladen på vandhanen med vandstråler, vask den ikke med hårde genstande, og tør den selv eller med en hårtørrer efter vask. Mikroskopisk undersøgelse, observer om der er tilbageværende bakterier eller andre sedimenter i hver celle. Hvis det ikke er rent, skal det vaskes gentagne gange, indtil det er rent.
