Forbedring af fordelene ved laserscanning multifotonmikroskopi
Laser scanning multifoton mikroskopi er en væsentlig forbedring i forhold til optisk mikroskopi. Den kan observere den dybe struktur af levende celler, fikserede celler og væv og kan opnå klare og skarpe flerlags Z-plan strukturer, det vil sige optiske sektioner, hvorfra den kan konstruere den tredimensionelle faste struktur af prøven. Konfokalmikroskopi bruger en laserlyskilde, der efter ekspansion fylder hele objektivlinsens bagerste brændplan og derefter passerer gennem objektivlinsens linsesystem for at konvergere til et meget lille punkt på prøvens brændplan. Afhængigt af den numeriske blænde på objektivlinsen er diameteren af det klareste belysningspunkt ca. 0.25 ~ 0.8μm, og dybden er ca. 0.5 ~ 1.5μm . Størrelsen af det konfokale punkt afhænger af mikroskopets design, laserbølgelængde, objektivets egenskaber, scanningsenhedens statusindstillinger og prøveegenskaber. Feltmikroskopi har et stort belysningsområde og dybde, hvorimod konfokalmikroskopi har en fokuseret belysning fokuseret på et brændpunkt i brændplanet. Den mest grundlæggende fordel ved konfokal mikroskopi er, at den kan udføre fin optisk sektionering af tykke fluorescerende prøver (som kan nå 5 0 μm eller mere), og tykkelsen af sektionerne er omkring 0,5 til 1,5 μm. En række optiske snitbilleder kan opnås ved at flytte prøven op og ned ved hjælp af mikroskopets Z-akse stepmotor. Indsamlingen af billedinformation styres inden for planet og vil ikke blive forstyrret af signaler, der udsendes fra andre steder på prøven. Efter at have fjernet indflydelsen fra baggrundsfluorescens og øget signal-til-støj-forhold, er kontrasten og opløsningen af konfokale billeder væsentligt forbedret sammenlignet med traditionelle feltbelyste fluorescensbilleder. I mange eksemplarer er mange indviklede strukturelle komponenter sammenflettet for at danne komplekse systemer, men når nok optiske sektioner kan indsamles, kan vi rekonstruere dem i tre dimensioner gennem software. Denne eksperimentelle metode er blevet brugt i vid udstrækning i biologisk forskning for at belyse de komplekse strukturelle og funktionelle forhold mellem celler eller væv.
