Funktioner og anvendelser af konfokal lasermikroskopi
Laser scanning confocal microscope (LSCM) er en type mikroskop designet baseret på konjugeret fokusteknologi, det vil sige at gøre laserlyskilden, prøven under test og detektoren alle i den konjugerede position af hinanden.
Grundlæggende
I almindelige mikroskoper falder objektivlinsens brændplan sammen med detektoren, således at det observerede billedplan er isoleret fra det tilstødende aksiale plan, mens prøven i konfokale mikroskoper belyses ved at bruge en diffraktionsbegrænset lysplet, og i Denne isoleringseffekt opnås ved at bruge et nålehul i opsamlingslysvejen ved punktkonjugatets brændpunkt for at filtrere strølys for at forbedre opløsningen.
Billedbehandlingsfunktioner
Kun det lys, der reflekteres tilbage fra det konjugerede prøvelag, kan passere gennem det lille hul i opsamlingslysvejen, og de resterende irrelevante prøvelagsrefleksioner blokeres af det lille hul. Dette kan resultere i en betydelig stigning i opløsning. Nedenfor er vist en side om side sammenligning af multidimensionel fluorescensmikroskopi og konfokal mikroskopi af den samme tykke prøve. Når en række billeder tages i forskellige brændplaner, kan det, der almindeligvis omtales som en "z-stack", genereres, og dette billede viser både opløsnings- og kontrastforstærkningerne, der tilbydes af konfokalmikroskopi og de underliggende årsager til disse gevinster. Undersøgelse af billedet i toppen af stakken med billeddannelsesplanet over vævet afslører en masse spredt lys i fluorescensbilledet, hvorimod det konfokale billede ser sort ud. Denne reduktion i PSF i aksial retning er direkte ansvarlig for forskellen i opløsning observeret ved den optiske grænseflade i midten af z-stakken.
Et andet træk ved laserscanningskonfokalmikroskopi er, at det er en scanningsteknologi. Den traditionelle bredfeltsbelysningsteknologi belyser hele prøven, så billedet kan optages direkte med det blotte øje eller en detektor, men LSCM bruger en stråle eller flere fokuserede stråler passerer gennem prøven til scanning og billeddannelse, og det resulterende billede er kaldet en optisk sektion. Det følgende viser forskellen mellem den traditionelle bredfeltsbelysningsmetode og den konfokale belysningsmetode med laserscanning.
Derfor er en praktisk arbejdsmetode for et moderne konfokalmikroskop vist i nedenstående figur. Det excitationslys, der udsendes af laseren, passerer gennem et dikroisk spejl og scanner i x- og y-retningerne af prøven gennem et par vibrerende spejle. Excitationen (eller reflektionen) af prøven. Lyset kommer ind i PMT-detektoren gennem nålehullet og optages, og det optagede scanningsbillede rekonstrueres af computeren for at opnå det faktiske prøvebillede.
