Hvor meget ved du om fluorescensmikroskopi
Fluorescensmikroskoper bruger generelt højintensive kviksølvlamper som excitationslyskilder. Filtre bruges til at bortfiltrere uønsket lys og efterlader kun det højintensive, rene lys, der exciterer fluoroforen. Efter at det monokromatiske lys har bestrålet prøven gennem objektivlinsen, vil prøven blive exciteret til at udsende lys (fluorescens), og både fluorescensen og excitationslyset vil vende tilbage langs objektivlinsens optiske bane. I dette tilfælde kræves et dikroisk spejl for at filtrere excitationslyset. , og lader kun den fluorescens, vi skal gennemskue.
Denne fluorescens når okularet langs mikroskopets lysbane og kommer derefter ind i vores øjne, hvor vi kan se fluorescensen udsendt af fluoroforen.
Forhåndstjek og justering af fluorescensmikroskopet:
(1) Før hver fluorescensobservation er det nødvendigt rutinemæssigt at kontrollere fluorescensindretningens filamentjustering, fokus på optisk vej, blændeblænde og feltmembranindstillinger.
(2) Om den påkrævede fluorescensexcitations-/emissionsfiltersamling er blevet installeret i konverteren, om fluorescensmikroskopets objektivlinse er korrekt konfigureret, og fjern oliepletter og støv på objektivlinsens frontlinse.
(3) Hvis fasekontrastobservation af transmitteret lys udføres på samme tid, er det nødvendigt at kontrollere konjugationen af centrum af kondensatoren og fasekontrastringen modsat objektivlinsen.
(4) Kontroller, om prøveholderen (skydeglas, dækglas og andre redskaber) er dækket af væske eller støv, og om tykkelsen er inden for objektivlinsens kalibrerede arbejdsafstandsområde. Den udskårne prøve må ikke være for tyk, helst mindre end eller lig med 10 μm.
(5) Fordi lyskilden indeholder ultraviolette stråler, placeres en brun lysafskærmende plade over scenens front for at forhindre ultraviolette stråler i at beskadige nethinden.
(6) Spændingsustabilitet vil reducere højtrykskviksølvlampens levetid, og lyskildens strømforsyning er udstyret med en spændingsstabilisator.
(7) For at forlænge kviksølvlampens levetid kan den slukkes 15 minutter efter, at den er tændt; når kviksølvlampens fluorescerende effekt er slukket, skal den vente mindst 10 minutter for at genstarte kviksølvdampen for at køle ned og vende tilbage til den oprindelige tilstand, ellers vil lampens levetid blive påvirket.
Billedobservation med fluorescensmikroskop:
(1) Ca. 5-10 minutter efter at den fluorescerende lyskilde er tændt, har intensiteten af excitationslyset tendens til at være stabil, og prøven indlæses til observation; for at forhindre fluorescensslukning af prøven forårsaget af overdreven excitationslys under processen med at fokusere og lede efter objekter, zoom først fluorescensmikroskopet ud Juster excitationslyset til en moderat intensitet med en blændeblænde eller tilføje et ND-filter, og flytte prøvestadiet regelmæssigt. Når du har bekræftet spejlbilledet, skal du justere til den fluorescerende tilstand for optagelse og optagelse.
(2) Justeringer for dårlig billedkvalitet. Ud over prøveforberedelsesfaktorer er de nødvendige justeringer, der kan foretages:
① Udelad lysafskærmende eller lysbegrænsende enheder i den billeddannende optiske vej, såsom DIC-tilbehør, ND-filtre osv.
②Rejuster modtagerens fokus og blændediafragmastørrelsen på fluorescensmikroskopet.
③ Juster forsigtigt dækningsforskelskorrektionsringen på fluorescensmikroskopobjektivet.
Påføringspunkter for fluorescensmikroskopi
Fluorescensmikroskopi bruger "aktinisk fluorescens" billeddannelse. Hvis den valgte excitationsbølgelængde er i det nær-ultraviolette område (320-400nm), som er usynligt for det blotte øje, er emissionsspektret for fluorescens også kortere end den gennemsnitlige bølgelængde for almindelige lysspejllyskilder. forbedre. Højenergi-fotoner kolliderer med elektroner, hvilket får elektronerne til at gå fra grundtilstanden til den exciterede tilstand. Elektronerne i den exciterede tilstand er meget ustabile og vil falde tilbage til grundtilstanden. I denne proces vil en del af den termiske energi blive forbrugt, og nye fotoner vil blive udsendt. Den nye foton har en lavere energi end den oprindelige foton og har derfor en længere bølgelængde. Da den nye fotonbølgelængde er forskellig fra fotonbølgelængden af det indfaldende lys, adskilles de to lysstråler med forskellige bølgelængder ved en bestemt optisk behandlingsmetode, således at vi kun ser de udsendte nye fotoner (fluorescenssignal), dvs. fluorescensmikroskopet ser fluorescensbilleder.
