Introduktion til fluorescensmikroskopi
Fluorescensmikroskopi er at bestråle objektet farvet med fluorescein med kortbølgelængdelys, så det exciteres til at producere langbølgelængdefluorescens og derefter observeres. I et fluorescensmikroskop skal excitationslyset med en specifik bølgelængde vælges fra prøvens belysningslys for at generere fluorescens, og derefter skal fluorescensen adskilles fra det blandede lys fra excitationslyset og fluorescensen til observation. Derfor spiller filtersystemet en ekstremt vigtig rolle i udvælgelsen af en specifik bølgelængde. Fluorescensmikroskoper er meget udbredt inden for biologi, medicin og andre områder.
1. Hovedkomponenterne i fluorescensmikroskopet:
(A) Lyskilde: Lyskilden udstråler lys af forskellige bølgelængder (fra ultraviolet til infrarødt). det
(B) Excitationsfilter lyskilde: gennem lyset af en specifik bølgelængde, der kan få prøven til at producere fluorescens, mens den blokerer lys, der er ubrugeligt til at excitere fluorescens. det
(C) Fluorescerende prøver: generelt farvet med fluorescerende pigmenter. det
(D) Blokerende filter: blokerer excitationslyset, der ikke absorberes af prøven, og transmitterer selektivt fluorescensen, og nogle bølgelængder transmitteres selektivt i fluorescensen.
det
2. Klassificering af fluorescensmikroskoper:
Fluorescensmikroskoper er generelt opdelt i to typer: transmission og epi-emission:
en. Transmissionstype: excitationslyset kommer fra bunden af objektet, der skal inspiceres, og kondensatoren er en mørkfeltskondensator, således at excitationslyset ikke kommer ind i objektivlinsen, men fluorescensen kommer ind i objektivlinsen. Det er lyst ved lav forstørrelse, men mørkt ved høj forstørrelse. Det er vanskeligt at arbejde i olienedsænkning og centrering. Det er især svært at bestemme lysområdet ved lave forstørrelser, men det kan få en meget mørk synsfeltsbaggrund. Transmissionstypen bruges ikke til ikke-gennemsigtige objekter. det
b. Epi-type: Transmissionstypen er næsten elimineret på nuværende tidspunkt. De fleste af de nye fluorescensmikroskoper er epi-type. Lyskilden kommer ovenfra objektet, der skal inspiceres, og der er en stråledeler i den optiske vej, så den er velegnet til både transparente og uigennemsigtige genstande, der skal inspiceres. Da objektivlinsen fungerer som en kondensatorlinse, er den ikke kun nem at betjene, men kan også opnå ensartet belysning af hele synsfeltet fra lav forstørrelse til høj forstørrelse. det
det
3. Forholdsregler for fluoroskopi
en. Langtidsbestråling af excitationslys vil forårsage fluorescensdæmpning og quenching, så forkort observationstiden så meget som muligt, og brug en baffel til at dække excitationslyset, når der ikke observeres midlertidigt. det
b. Når du observerer med en olienedsænkningslinse, skal du bruge "ikke-fluorescerende olie". det
c. Fluorescens er næsten altid svag og bør udføres i et mørkt rum. det
d. Det er bedst at installere en spændingsstabilisator i strømforsyningen, ellers vil den ustabile spænding ikke kun reducere kviksølvlampens levetid, men også påvirke effekten af mikroskopinspektionen. det
det
4. Anvendelse af fluorescensmikroskopi
1. Forberedelseskrav til fluorescensmikroskopprøver
en. Glasrutsjebane
Tykkelsen af glaspladen skal være mellem 0,8 og 1,2 mm. Et objektglas, der er for tykt, vil på den ene side absorbere mere lys, og på den anden side kan excitationslyset ikke koncentreres på prøven. Slides skal være glatte, ensartede i tykkelse og fri for tydelig autofluorescens. Nogle gange bruges kvartsglasglas. det
b. Dækglas
Tykkelsen af dækglasset er ca. 0.17 mm, glat. For at styrke excitationslyset kan der også bruges et tørt dækglas, som er et specielt dækglas belagt med flere lag af stoffer (såsom magnesiumfluorid), der har forskellige interferenseffekter på lys af forskellige bølgelængder, hvilket kan gøre at fluorescens går glat. Excitationslys ledes igennem, og det reflekterede excitationslys exciterer prøven. det
c. Prøve
Vævsskiver eller andre prøver må ikke være for tykke. Hvis det er for tykt, vil det meste af excitationslyset blive forbrugt i den nederste del af prøven, mens den øverste del, som direkte observeres af objektivlinsen, ikke kan exciteres helt. Derudover overlapper celler eller urenheder dækker op, hvilket påvirker bedømmelsen. det
d. Monteringsmiddel
Glycerin bruges almindeligvis som et monteringsmiddel, som ikke må have nogen autofluorescens, farveløst og gennemsigtigt, og lysstyrken af fluorescensen er lysere ved pH 8.5-9.5, og det er ikke let at falme hurtigt. Derfor bruges en ensartet blanding af glycerol og 0.5mol/L carbonatbufferopløsning med en pH-værdi på 9.0 til 9.5 almindeligvis som monteringsmiddel. det
e. spejl olie
Generelt skal der anvendes immersionsolie, når man observerer prøver med mørkfeltsfluorescensmikroskoper og nedsænkningsobjektiver for olie. Det er bedst at bruge speciel ikke-fluorescerende spejlolie, som også kan erstattes af ovennævnte glycerin, og flydende paraffin kan også bruges, men brydningsindekset er lavt, hvilket en smule påvirker billedkvaliteten.
