Laser konfokalmikroskop funktioner og applikationer
Mens observationens billedplan i et normalt mikroskop er isoleret fra de tilstødende aksiale planer ved at overlappe objektivlinsens brændplan med detektoren, opnås denne isolation i et konfokalt mikroskop ved at belyse prøven med et diffraktionsbegrænset punkt på lys og filtrering af omstrejfende lys ved at bruge et nålehul i vejen for opsamlet lys ved det konjugerede fokus for dette lyspunkt for at opnå denne isolation og dermed forbedre opløsningen.
Kun det lys, der reflekteres tilbage fra det konjugerede prøvelag, kan passere gennem nålehullet i opsamlingslysvejen, mens resten af de irrelevante prøvelagsrefleksioner blokeres af nålehullet. Dette giver en markant stigning i opløsning. Nedenfor er vist en side-by-side sammenligning af multidimensionel fluorescensmikroskopi og konfokal mikroskopi af den samme tykke prøve. Når en række billeder tages i forskellige brændplaner, produceres et billede, der almindeligvis omtales som en "z-stack", som viser opløsnings- og kontrastforstærkningerne fra konfokal mikroskopi og de underliggende årsager til disse gevinster. Det kan ses, at undersøgelse af billedet i toppen af stakken, hvor billedplanet er over vævet, afslører en stor mængde spredt lys i fluorescensbilledet, hvorimod det konfokale mikroskopbillede ser sort ud. Denne reduktion i PSF i den aksiale retning bidrager direkte til forskellen i opløsning observeret ved den optiske grænseflade i midten af z-stakken.
Optisk skive scanning billeddannelse
Et andet træk ved laserscanningskonfokalmikroskopi er, at det er en scanningsteknik. Traditionelle bredfeltsbelysningsteknikker belyser hele prøven, så billedet kan fanges direkte med det blotte øje eller en detektor, men LSCM bruger en eller flere fokuserede lysstråler til at scanne gennem prøven, så det resulterende billede kaldes en optisk skive, som vist i følgende diagram. Forskellen mellem traditionel bredfeltsbelysning og konfokal laserscanning er vist nedenfor.
Derfor er en praktisk måde at moderne konfokal mikroskopi vist i figuren nedenfor. Excitationslyset fra laseren føres gennem et dikroisk spejl og scannes gennem et par galvanometerspejle i x-retningen og y-retningen af prøven, og excitationen (eller reflektionen) af prøven passerer gennem et nålehul ind i PMT'en. detektor, der skal optages, og det registrerede scannede billede rekonstrueres af en computer for at frembringe et faktisk billede af prøven.
