Laser konfokal mikroskopi - funktioner og anvendelser
Laser scanning konfokal mikroskopi (LSCM) er en type mikroskop designet baseret på konjugeret fokusteknologi, det vil sige laserlyskilden, prøven, der skal måles, og detektoren er alle i konjugerede positioner med hinanden.
Grundlæggende
I et generelt mikroskop er billedplanet for observation isoleret fra det tilstødende aksiale plan ved at falde sammen objektivlinsens brændplan med detektoren, mens der i et konfokalt mikroskop bruges en diffraktionsbegrænset lysplet til at belyse prøven og A. pinhole bruges i den opsamlede lysbane ved lysplettens konjugerede fokus for at filtrere spredt lys for at skabe denne isolationseffekt og derved forbedre opløsningen.
Billedbehandlingsfunktioner
Optisk sektionsscanning
Et andet træk ved laserscanningskonfokalmikroskopi er, at det er en scanningsteknologi. Den traditionelle bredfeltsbelysningsteknologi belyser hele prøven, så billedet kan optages direkte med det blotte øje eller en detektor, men LSCM bruger en stråle eller flere fokuserede stråler passerer gennem prøven til at scanne og afbilde. Det resulterende billede kaldes en optisk sektion. Det følgende viser forskellen mellem den traditionelle bredfeltsbelysningsmetode og den konfokale belysningsmetode med laserscanning.
Derfor er en egentlig arbejdsmetode for et moderne konfokalmikroskop som vist på figuren nedenfor. Excitationslyset, der udsendes af laseren, passerer gennem et dikroisk spejl og scannes i x-retningen og y-retningen af prøven gennem et par galvanometre. Excitationen (eller reflektionen) af prøven er. Lys trænger ind i PMT-detektoren gennem nålehullet og optages, og det optagede scannede billede rekonstrueres af en computer for at rekonstruere det faktiske prøvebillede.
Generer "z-stack" billeder på forskellige brændplaner
Kun det lys, der reflekteres tilbage fra det konjugerede prøvelag, kan passere gennem det lille hul i opsamlingslysvejen, og de resterende irrelevante prøvelagsrefleksioner blokeres af det lille hul. Dette kan resultere i betydelige opløsningsforbedringer. Side-by-side sammenligning af multidimensionel fluorescensmikroskopi og konfokal mikroskopi af den samme tykke prøve. Når en række billeder tages i forskellige brændplaner, kan der genereres billeder, der almindeligvis omtales som "z-stacks", som illustrerer opløsnings- og kontrastforstærkningerne, der tilbydes af konfokalmikroskopi, og de underliggende årsager til disse gevinster. Det kan ses, at undersøgelse af billedet i toppen af stakken med billeddannelsesplanet over vævet afslører en stor mængde spredt lys i fluorescensbilledet, hvorimod det konfokale mikroskopibillede ser sort ud. Denne reduktion i aksial PSF resulterer direkte i opløsningsforskellen observeret ved den optiske grænseflade i midten af z-stakken.
Opløsningen er væsentligt forbedret sammenlignet med widefield-belysning
I fluorescensmikroskopi er lysintensiteten udsendt fra et enkelt punkt beskrevet af punktspredningsfunktionen (PSF), og dens mønster er en luftig disk. Opløsningen af fluorescenssystemet kan beskrives ved radius af Airy disken, som kan beskrives ved Den numeriske blænde på objektivlinsen og bølgelængden af excitationslyset bestemmer
