Lavpris fluorescens og lysfeltmikroskopdesign
I denne guide vil jeg gennemgå de grundlæggende principper for fluorescensmikroskopi og hvordan man konstruerer tre forskellige billige fluorescensmikroskoper. Disse systemer koster typisk tusindvis af dollars, men de seneste bestræbelser har gjort dem lettere at få fat i. Det design, jeg introducerer her, bruger smartphones, dSLR og USB-mikroskoper. Alle disse designs kan også bruges som åbenfeltsmikroskoper.
Trin 1: Oversigt over fluorescensmikroskopi
For at forstå de grundlæggende begreber i fluorescensmikroskopi, forestil dig de tætte skove, træer, dyr, buske og andre skove, der lever i skoven om natten. Hvis du kaster en lommelygte ind i skoven, vil du se alle disse strukturer, og det er svært at forestille sig specifikke dyr eller planter. Forudsat at du kun er interesseret i at se blåbærbuske i skoven. For at opnå dette skal du træne ildfluer til kun at blive tiltrukket af blåbærbuske, så når du ser ud i skoven, vil kun blåbærbuske lyse op. Man kan sige, at man markerede blåbærbuskene med ildfluer, så man kan se blåbærstrukturerne i skoven.
I denne analogi repræsenterer skoven hele prøven, blåbærbusken repræsenterer den struktur, du ønsker at visualisere (såsom specifikke celler eller subcellulære organeller), og ildfluer er fluorescerende forbindelser. Situationen med at skyde en lommelygte alene uden ildfluer ligner et lysfeltmikroskop.
Det næste trin er at forstå de grundlæggende funktioner af fluorescerende forbindelser (også kendt som fluoroforer). Fluorescerende klynger er faktisk små objekter (nanoskala) designet til at forbinde specifikke strukturer i prøven. De absorberer lys med et snævert bølgelængdeområde og genudsender lys af en anden bølgelængde. For eksempel kan en fluorescerende gruppe absorbere blåt lys (dvs. den fluorescerende gruppe exciteres af blåt lys) og derefter udsende grønt lys igen. Normalt opsummeres dette gennem excitations- og emissionsspektre (som vist i figuren ovenfor). Disse diagrammer viser bølgelængderne af lys absorberet af fluoroforen og bølgelængderne af lys udsendt af fluoroforen.
Mikroskopets design minder meget om et almindeligt åbent feltmikroskop med to hovedforskelle. For det første skal lyset, der belyser prøven, være på bølgelængden af den exciterede fluorescerende gruppe (for eksemplet ovenfor er lyset blåt). For det andet behøver mikroskopet kun at opsamle udsendt lys (grønt lys), mens det blokerer blåt lys. Dette skyldes, at blåt lys er overalt, men grønt lys kommer kun fra specifikke strukturer i prøven. For at blokere blåt lys har mikroskoper normalt noget, der kaldes et langpasfilter, der tillader grønt lys at passere igennem uden blåt lys. Hvert langpasfilter har en afskæringsbølgelængde. Hvis lysets bølgelængde er større end cutoff-bølgelængden, kan det passere gennem et filter. Derfor er navnet "Long Distance Pass". Kortere bølgelængder er blokeret.
Trin 2: Modellering af et mikroskop ved hjælp af optisk optik
Dette er et ekstra trin i udformningen af det grundlæggende princip for et mikroskop. Der er ingen grund til at bygge et fluorescensmikroskop, så hvis du ikke vil dykke ned i optik, kan du springe det over.
Både lysfelt- og fluorescensmikroskoper kan modelleres ved hjælp af stråleoptiske enheder. Den grundlæggende forudsætning for stråleoptik er, at lysets opførsel svarer til lysets opførsel væk fra en lyskilde. Når du ser dig omkring i rummet, vil du se sollys uden for vinduet eller lyset, som pæren bringer. Så absorberes eller reflekteres lyset af genstande i rummet. Noget reflekteret lys vil få det til at vende mod dine øjne. Hvis en genstand er oplyst, kan du forestille dig, at hvert punkt på objektet udsender lys i alle retninger (som vist på billedet ovenfor). Linsen, som linsen i vores øjne, fokuserer lyset til et punkt, så vi kan se objektet. Uden en linse fortsætter lyset med at forplante sig udad og danner ikke et billede.
