Mikroskopisk klassificering og arbejdsprincip for celleforskning
Mikroskopet er det primære værktøj til at observere celler. Ifølge forskellige lyskilder kan det opdeles i to kategorier: optiske mikroskoper og elektronmikroskoper. Førstnævnte bruger synligt lys (UV-mikroskoper bruger ultraviolet lys) som lyskilde, mens sidstnævnte bruger elektronstråler som lyskilde.
-,Optisk mikroskop
(1) Almindelig optisk mikroskop
Almindelige biologiske mikroskoper er sammensat af tre dele, nemlig: ① belysningssystem, inklusive lyskilde og kondensator; ② optisk forstørrelsessystem, sammensat af objektivlinse og okular, som er hoveddelen af mikroskopet. For at eliminere sfærisk aberration og kromatisk aberration bruges både okularet og objektivet ③Mekanisk anordning til at fiksere materialet og lette observation (figur 2-1).
Hvorvidt billedet af mikroskopet er klart afgøres ikke kun af forstørrelsen, men også relateret til mikroskopets opløsning. Opløsningen refererer til mikroskopets (eller det menneskelige øjes evne til at være 25 cm væk fra målet) til at skelne mellem den mindste afstand mellem objekter. Størrelsen af opløsningen bestemmes af lysets bølgelængde og blændeforhold og mediets brydningsindeks er udtrykt med formlen:
I formlen: n=brydningsindeks for medium;=blændevinkel (prøvens åbningsvinkel i forhold til objektivets blænde), NA=objektivets blænde (numerisk blænde). Linsevinklen er altid mindre end 180 grader, så den maksimale værdi for sina/2 skal være mindre end 1.
Brydningsindekset for glasset, der bruges til at fremstille den optiske linse, er 1,65 til 1,78, og brydningsindekset for det anvendte medium er tættere på glasset, jo bedre. For tørre objektiver er mediet luft, og objektivets blændeforhold er generelt 0.05 til 0,95; til olielinser bruges cederolie som medium, og objektivets blændeforhold kan være tæt på 1,5.
Bølgelængden af almindeligt lys er {{0}}nm, så opløsningsværdien af mikroskopet vil ikke være mindre end 0.2μm, og opløsningen af det menneskelige øje er 0,2 mm, så maksimal forstørrelse af det generelle mikroskopdesign er normalt 1000X.
(2) Fluorescensmikroskopi
Nogle stoffer i celler, såsom klorofyl, kan fluorescere efter at være blevet bestrålet af ultraviolette stråler; nogle stoffer kan ikke selv fluorescere, men hvis de er farvet med fluorescerende farvestoffer eller fluorescerende antistoffer, kan de også fluorescere, når de bestråles med ultraviolette stråler, og fluorescensmikroskopet (fig. 2-2, 3, 4) er et af værktøjerne til kvalitativ og kvantitativ forskning i sådanne stoffer.
Fluorescensmikroskoper og almindelige mikroskoper har følgende forskelle:
1. Belysningsmetoden er normalt epi-illumination, det vil sige, at lyskilden projiceres på prøven gennem objektivlinsen (figur 2-3);
2. Lyskilden er ultraviolet lys, bølgelængden er kortere, og opløsningen er højere end almindelige mikroskopers;
3. Der er to specielle filtre, det ene foran lyskilden bruges til at filtrere synligt lys fra, og det mellem okularet og objektivlinsen bruges til at filtrere ultraviolet lys fra for at beskytte øjnene.
(3) Laser scanning konfokal mikroskop
Laserkonfokalt scanningsmikroskop (laserkonfokalt scanningsmikroskop, figur 2-5, 6) bruger laser som scanningslyskilde og scanner billeddannelse punkt for punkt, linje for linje, overflade for overflade, og scannende laser- og fluorescenssamling deler en objektivlinsen, og objektivlinsens fokus er Scanningslaserens brændpunkt er også genstandspunktet for øjeblikkelig billeddannelse. Fordi laserstrålens bølgelængde er kort, og strålen er meget tynd, har det konfokale laserscanningsmikroskop en højere opløsning, som er omkring 3 gange så stor som et almindeligt optisk mikroskop. Systemet fokuseres én gang, og scanningen er begrænset til ét plan af prøven. Når fokuseringsdybden er forskellig, kan der opnås billeder af forskellige dybdeniveauer af prøven. Disse billedoplysninger gemmes på computeren. Gennem computeranalyse og simulering kan den tredimensionelle struktur af celleprøven vises.
Konfokal laserscanningsmikroskopi kan bruges ikke kun til at observere cellemorfologi, men også til kvantitativ analyse af intracellulære biokemiske komponenter, optisk tæthedsstatistik og måling af cellemorfologi.
(4) Mørkefeltsmikroskop
Mørkefeltsmikroskopet (mørkefeltsmikroskop, figur 2-7) har et lysark i midten af kondensatoren, så belysningslyset ikke kommer direkte ind i den menneskelige linse, og kun lyset reflekteret og diffrakteret af prøven får lov til at komme ind i objektivlinsen, så baggrunden for synsfeltet er sort, kanterne på objekter er lyse. Ved hjælp af dette mikroskop kan partikler så små som 4-200nm ses, og opløsningen kan være 50 gange højere end for almindelige mikroskoper.
(5) Fasekontrastmikroskop
Fasekontrastmikroskop (fasekontrastmikroskop, figur 2-8, 9) af P. Zernike blev opfundet i 1932 og vandt Nobelprisen i fysik i 1953 for det. Det største træk ved dette mikroskop er, at det kan observere ufarvede prøver og levende celler.
Det grundlæggende princip for fasekontrastmikroskopi er at ændre den optiske vejforskel af det synlige lys, der passerer gennem prøven, til en amplitudeforskel, og derved forbedre kontrasten mellem forskellige strukturer og gøre forskellige strukturer klart synlige. Efter at have passeret gennem prøven brydes lyset, afviges fra den oprindelige optiske vej og forsinkes med 1/4λ (bølgelængde). Styrk, øg eller mindsk amplituden, øg kontrasten. Med hensyn til struktur har fasekontrastmikroskoper to specielle funktioner, der er forskellige fra almindelige optiske mikroskoper:
1. Den ringformede membran er placeret mellem lyskilden og kondensatoren, og dens funktion er at få lyset, der passerer gennem kondensatoren, til at danne en hul lyskegle og fokusere på prøven.
2. Fasepladen (ringformet faseplade) tilføjer en faseplade belagt med magnesiumfluorid i objektivlinsen, som kan forsinke fasen af direkte lys eller diffrakteret lys med 1/4λ. Der er to typer:
①A plus faseplade: Det direkte lys er forsinket med 1/4λ. Efter at de to grupper af lysbølger er kombineret, lægges lysbølgerne sammen, og amplituden øges. Strukturen af prøven er lysere end det omgivende medium og danner en lys kontrast (eller negativ kontrast).
② B plus faseplade: Det diffrakterede lys er forsinket med 1/4λ. Efter at de to sæt stråler er kombineret, trækkes lysbølgerne fra, og amplituden bliver mindre og danner en mørk kontrast (eller positiv kontrast), og strukturen er mørkere end det omgivende medium.
(6) Polariserende mikroskop
Polariserende mikroskop bruges til at detektere stoffer med dobbeltbrydning, såsom filamenter, spindler, kollagen, kromosomer og så videre. Forskellen fra almindelige mikroskoper er, at der er en polarisator (polarisator) foran lyskilden, således at lyset der kommer ind i mikroskopet er polariseret lys, og der er en analysator (en polarisator, hvis polarisationsretning er vinkelret på polarisatoren) i linserøret. Scenen af dette mikroskop kan roteres. Når et enkeltbrydende stof placeres på scenen, uanset hvordan scenen drejes, da de to polarisatorer er lodrette, kan der ikke ses lys i mikroskopet, og lyset er ikke synligt i mikroskopet. Når det kommer ind i dobbeltbrydende materialer, kan det roterende trin detektere sådanne genstande, fordi lys afbøjes, når det passerer gennem sådanne materialer.
