Multifotonmikroskopi-billeddannelsesteknologi: polarisations-opløst anden-harmonisk generationsmikroskopi og dens billedbehandling
I ikke-lineære optiske mikroskoper bruges anden harmonisk generation (SHG) billeddannelse almindeligvis til at observere endogene fibrøse strukturer, og intensiteten af SHG afhænger i høj grad af den relative vinkel mellem polarisationsretningen af den indfaldende stråle og målmolekylets orienteringsakse. Derfor kan polarisationsbaseret SHG-billeddannelse (P-SHG) opnå strukturel information om målmolekyler ved at analysere det funktionelle forhold mellem SHG-signalintensitet og polarisationstilstanden af den indfaldende stråle. Det bruges nu som et vigtigt værktøj til medicinsk og biologisk analyse.
Simple SHG-billeder kan opnås gennem traditionel to-fotonexcitationsfluorescensmikroskopi (TPM). De fleste TPM-systemer bruger stadig en enkeltstråle-scanningsmetode baseret på et bevægeligt spejl, hvis tidsopløsning afhænger af spejlets fysiske bevægelseshastighed. For at opnå hurtigere billeddannelse kan TPM-systemet også anvende en multistråle-scanningsmetode (figur 1A), hvoraf den ene er at bruge en roterende disk-scanningsenhed. Denne enhed består af en koaksial mikrolinsepladespiller og en pinhole-pladespiller, hvor mikrolinserne og pinholes på hver drejeskive svarer til en-til-en.
Når laseren passerer gennem mikrolinsepladespilleren, dækker bølgefronten flere mikrolinser. Forskellige mikrolinser fokuserer forskellige dele af bølgefronten til forskellige positioner og passerer gennem tilsvarende nålehuller og danner flere mikrostråler. Disse mikrostråler, der rammer prøven, kan excitere flere signaler samtidigt. Disse signaler vender tilbage langs mikroskopsystemet og passerer gennem nålehullet igen og reflekteres til sidst af det dikroiske spejl mellem de to pladespillere ind i detektionsanordningen. Den almindeligt anvendte tilstand-låst titanium safirlaser som lyskilde har imidlertid utilstrækkelig energi, hvilket begrænser antallet af excitationsstråler og resulterer i et lille effektivt synsfelt (FOV) for TPM (TPM-SD) ved hjælp af en roterende scanningsenhed.
Ai Goto et al. rettet mod at opnå høj-hastighed P-SHG-billeddannelse med et stort synsfelt (FOV) ved hjælp af TPM-SD-systemet. Derfor blev en Yb-baseret laserkilde med højere spidseffekt introduceret i TPM-SD-systemet.
Dette er et skematisk diagram over det TPM-SD-system, de udviklede. Systemets lyskilde er en Yb-baseret laser, som genererer femtosekundpulser med en centerbølgelængde på 1042 nm, en gennemsnitlig effekt på 4 W, en pulsbredde på 300 fs og en gentagelseshastighed på 10 MHz. Systemet justerer først lasereffekten gennem en halvbølgeplade og en Glan laserpolarisator, og udvider derefter strålen gennem en stråleudvider. Den udvidede stråle indføres i pladespillerens scanningsenhed, og flere mikrostråler, der kommer ud af scanningsenheden, fokuseres på flere punkter af prøven gennem en vandnedsænkningsobjektiv. For at justere polarisationstilstanden af lysstrålen ved objektivlinsen placeres en halvbølgeplade og en kvartbølgeplade på excitationsstrålens optiske vej.
