Optiske egenskaber af biologiske mikroskoper
Mikroskopets optiske ydeevne bestemmes af følgende otte grundlæggende optiske parametre (eller parametre):
(1) Numerisk blænde
Numerisk blænde kaldes også spejlforhold. Det refererer til produktet af brydningsindekset n for mediet mellem det observerede objekt og linsen og sinusværdien af halvdelen af objektivlinsens vinkel. Brug NA eller A. til at repræsentere. NA=nsin( /2)
Den såkaldte spejlmundvinkel refererer til vinklen mellem de marginale stråler fra det observerede punkt, der kommer ind i objektivlinsens frontlinse.
Den numeriske blænde er en vigtig parameter for objektivlinsen og kondensatorlinsen og er tæt forbundet med andre optiske parametre i mikroskopet. Det er generelt håbet, at jo større jo bedre. Det kan ses af formlen, at der er to måder at øge den numeriske blænde på, den ene er at øge spejlmundingsvinklen, og den anden er at øge brydningsindekset mellem objektivlinsen og prøven.
Når førstnævnte metode er vedtaget, kan prøven og genstanden holdes så tæt på som muligt. Men uanset hvor tæt, er det altid mindre end 180 grader. Således er sin( /2) også mindre end 1. Luftens brydningsindeks er n=1. Derfor er den numeriske blænde nsin( /2) for den tørre objektivlinse altid mindre end 1, generelt mellem 0,04 og 0,95.
Når sidstnævnte metode anvendes, kan der tilføjes et medium med et højere brydningsindeks mellem objektivlinsen og prøven. For eksempel er brydningsindekset for cederolie n=1.515. Når cederolie bruges som medium, kan den numeriske blænde nå op på mere end 1,2. Derfor bruges der i nogle tilfælde oliebriller. På nuværende tidspunkt er den maksimale numeriske blænde, som olielinsen kan opnå, 1,4.
(2) Opløsning
Opløsning kaldes også diskriminationshastighed eller opløsningsevne. Den såkaldte opløsning refererer til mikroskopets evne til at skelne den fine struktur af objektet under inspektion. Den er omvendt proportional med opløsningsafstanden. Opløsningsafstanden refererer til den mindste afstand mellem to objektpunkter, der kan skelnes. Jo mindre opløsningsafstanden er, jo højere opløsning har mikroskopet. Hvis afstanden mellem to objektpunkter er mindre end opløsningsafstanden, vil de to punkter blive forvekslet med ét punkt, og dets struktur kan ikke ses tydeligt. Opløsningen af mikroskopet bestemmes af objektivlinsen. Okularer forstørrer kun og øger ikke mikroskopets opløsning.
I tilfælde af normal central belysning bestemmes objektivlinsens opløsningsafstand d af følgende formel.
d=(λ/2)N.A.
I formlen: d repræsenterer opløsningsafstanden, enheden er mikron, λ repræsenterer bølgelængden af belysningslyset, enheden er også mikron.
I synligt lys er bølgelængden med den største lysstyrke og den mest følsomme over for menneskelige øjne {{0}},55 μm, og objektivlinsens maksimale NA er 1,4. Ved at indsætte i ovenstående formel er d ca. 0,2 μm. Det vil sige, at med et almindeligt optisk mikroskop er grænsen for opløsningsafstanden 0,2 μm i tilfælde af central belysning. Det vil sige, at almindelige optiske mikroskoper ikke kan skelne mellem to objekter mindre end 0,2 μm.
Ved hjælp af ultraviolet lys kan bølgelængden af belysningslyset reduceres, hvilket gør det muligt for opløsningsafstanden at nå 0.1 μm. Men ultraviolette stråler kan ikke ses af det menneskelige øje. Det kan kun observeres efter at have taget et billede.
Bølgelængden af elektronstrøm er kun 0.00387 nm. Ved at bruge "elektronlinse" eller magnetisk linse til at styre strømmen af elektroner, er opløsningsafstanden for elektronmikroskopet op til et par tiendedele af en nanometer. Det kan bruges til at observere strukturen af atomer.
(3) Forstørrelse
Mikroskopets forstørrelse er lig med produktet af forstørrelsen af objektivlinsen og forstørrelsen af okularet. I princippet kan forstørrelsen gøres meget stor. Men hvis detaljerne i prøven ikke kan løses af objektivlinsen, uanset hvor stor forstørrelsen er, er det meningsløst. Teoretisk kan det udledes, at den bedst egnede forstørrelse af mikroskopet (kaldet den effektive forstørrelse, repræsenteret ved M effektivt) er mellem 500 og 1000 gange objektivlinsens numeriske blænde. Det vil sige 500N.A. Mindre end eller lig med M effektiv Mindre end eller lig med 1000N.A.
Inden for det effektive forstørrelsesområde kan øjnene observere i lang tid uden at blive træt. Hvis forstørrelsen er lavere end 500 NA, vil den være svær at observere. Hvis det er højere end 1000N.A., vil det forringe billedkvaliteten og endda forårsage et uvirkeligt billede. Derfor er forstørrelsen over 1000N.A. kaldes ugyldig forstørrelse.
(4) Arbejdsafstand
Arbejdsafstanden refererer til afstanden mellem den nedre overflade af objektivlinsen og den øvre overflade af dækglasset, efter at mikroskopet er fokuseret, ved hjælp af et standard dækglas og en standard mekanisk rørlængde. Jo højere forstørrelsen af objektivlinsen er, jo kortere er arbejdsafstanden. Generelt er arbejdsafstanden for laveffekt objektivlinsen under 10 gange 5-7mm, mens arbejdsafstanden for 100 gange olielinsen kun er omkring 0,19 mm.
(5) Dybde af fokus
Når mikroskopet er fokuseret på et bestemt plan i prøven, kan ikke kun objektplanet ses tydeligt, men også de øvre og nedre objektplaner forbundet med det kan ses tydeligt på samme tid. Afstanden mellem det øvre og nedre objektplan kaldes fokusdybden eller forkortet fokusdybde.
Mikroskopets fokusdybde er meget lille, og jo større numerisk blænde, desto større er den samlede forstørrelse, og jo mindre er fokusdybden. For eksempel, når du bruger en olielinse med en NA på 1,25/100 gange og et 12,5 gange okular til at observere, er fokusdybden kun 0,27 μm. Det vil sige, at efter fokusering kun et tyndt lag på 0,27 μm tykt kan ses tydeligt ad gangen. Almindelige prøver er generelt flere mikrometer tykke. For at se hele prøven er det nødvendigt at bruge mikroskopets finjusteringsmekanisme til at observere i lag fra top til bund.
(6) synsfelt
Synsfeltet kaldes også synsfeltet. Henviser til omfanget af objektet under inspektion, som mikroskopet kan se på én gang. Normalt ønsker vi, at synsfeltet skal være så stort som muligt. Mikroskopets synsfelt bestemmes af objektivlinsens synsfelt og okularets synsfelt. Synsfeltet for almindelig objektivlinse er mindre end 20 mm, og den store kan nå mere end 40 mm. Synsfeltet på almindelige 10x okularer er 14 mm, og de store kan nå mere end 24 mm. Når først objektivet og okularet er designet, er deres synsfelt fast. Fordi synsfeltet af et generelt mikroskop er lille, er det umuligt at se hele prøven i ét synsfelt, kun en meget lille cirkel på prøven kan ses. Desuden er størrelsen af synsfeltet omvendt proportional med mikroskopets samlede forstørrelse. Jo større den samlede forstørrelse, jo mindre synsfeltet. Løsningen er at bruge moveren til at få hver del af prøven til at gå ind i synsfeltet på skift og observere på skift.
(7) Spejllysstyrke
Spejllysstyrke refererer til lysheden og mørket af objektbilledet set i mikroskopet. For at lette observation håber vi, at det resulterende billede er lysere. I tilfælde af konstant eksternt lys er spejlets lysstyrke proportional med kvadratet af den numeriske blænde og omvendt proportional med kvadratet af den samlede forstørrelse. For at gøre billedet lysere bør der bruges et objektiv med en stor numerisk blændeåbning med et okular med lav forstørrelse. For eksempel, i tilfælde af det samme objektiv, vil brug af et 5X okular producere et spejlbillede, der er 4 gange lysere end ved brug af et 10X okular.
For mikroskoper, der anvender elektriske lyskilder, kan lysstyrken af spejlbilledet styres ved at justere lysstyrken på belysningsinstrumentet.
(8) Klarhed
Klarheden af mikroskopafbildning afhænger af dets optiske system, især objektivlinsens optiske ydeevne. Det er relateret til design, fremstilling, brug og opbevaring af mikroskoper. Det er et vigtigt og komplekst spørgsmål. Fra brugs- og opbevaringsperspektivet er hovedårsagerne, der påvirker klarheden: tykkelsen af det anvendte dækglas er ukvalificeret, fokus er ikke justeret til den ideelle position, den samlede forstørrelse er for stor, og olielinsen linsen tørres ikke af. Rens, linsemeldug osv.
