Princip og anvendelse af fluorescensmikroskopi
(1) Fluorescensmikroskopets principielle og strukturelle karakteristika: fluorescensmikroskopet bruger en punktlyskilde med høj lyseffektivitet til at udsende lys af en bestemt bølgelængde (såsom ultraviolet lys 3650 tommer eller lilla blåt lys 4200 tommer) gennem filtersystemet som excitationslyset til at excitere prøven. Efter at det fluorescerende stof indeni udsender fluorescens af forskellige farver, observeres det gennem forstørrelsen af objektivlinsen og okularet. På denne måde, under en stærk kontrast baggrund, selv om fluorescensen er meget svag, er den let at identificere og har høj følsomhed. Det bruges hovedsageligt til forskning i cellestruktur og funktion og kemisk sammensætning. Den grundlæggende struktur af et fluorescensmikroskop er sammensat af et almindeligt optisk mikroskop plus noget tilbehør (såsom en fluorescerende lyskilde, et excitationsfilter, en tofarvet stråledeler og et blokeringsfilter osv.). Fluorescerende lyskilde - brug generelt ultrahøjtryks kviksølvlampe (50-200W), som kan udsende lys af forskellige bølgelængder, men hvert fluorescerende stof har en excitationsbølgelængde, der producerer den stærkeste fluorescens, så det er nødvendigt at tilføje en excitationsfilter (Generelt er der ultraviolette, lilla, blå og grønne excitationsfiltre), som kun tillader excitationslys med en vis bølgelængde at passere igennem og bestråle prøven, mens de absorberer andet lys. Efter at hvert stof er bestrålet med excitationslys, udsender det synlig fluorescens med en længere bølgelængde end bestrålingsbølgelængden på meget kort tid. Fluorescens er specifik og generelt svagere end excitationslys. For at observere specifik fluorescens kræves et blokerende (eller undertrykkende) filter bag objektivlinsen. Den har to funktioner: den ene er at absorbere og blokere excitationslyset i at trænge ind i okularet, for ikke at forstyrre fluorescensen og beskadige øjnene; den anden er at vælge og lade den specifikke fluorescens passere igennem og vise en specifik fluorescerende farve. De to filtre skal bruges sammen.
Der er to typer fluorescensmikroskoper med hensyn til deres optiske veje:
1. Transmissionsfluorescensmikroskop: Excitationslyskilden exciterer fluorescens gennem prøvematerialet gennem kondensatorlinsen. En mørk feltsamler bruges almindeligvis, og en almindelig solfanger kan også bruges til at justere spejlet, så excitationslyset transmitteres og omgås til prøven. Dette er et gammeldags fluorescensmikroskop. Fordelen er, at fluorescensen er stærk ved lav forstørrelse, og ulempen er, at fluorescensen falder med forøgelsen af forstørrelsen. Derfor er det bedre at observere større prøvematerialer.
2. Epi-fluorescensmikroskop Dette er en ny type fluorescensmikroskop udviklet i moderne tid. Forskellen er, at excitationslyset falder fra objektivlinsen til overfladen af prøven, det vil sige, at den samme objektivlinse bruges som belysningskondensatoren og objektivlinsen til opsamling af fluorescens. Der skal tilføjes en dikroisk stråledeler i lysvejen, som er 45 grader væk fra det lette uran. Excitationslyset reflekteres ind i objektivlinsen og opsamles på prøven. Fluorescensen genereret af prøven og excitationslyset, der reflekteres af objektivets linseoverflade og dækglasoverfladen, går ind i objektivlinsen på samme tid og vender tilbage til tofarvestråledeleren for at gøre excitationslyset adskilt fra fluorescens , absorberes resterende excitationslys af blokerende filtre. Hvis du skifter til en kombination af forskellige excitationsfiltre/tofarvede stråledelere/blokeringsfiltre, kan behovene for forskellige fluorescerende reaktionsprodukter opfyldes. Fordelen ved denne form for fluorescensmikroskop er, at belysningen af synsfeltet er ensartet, billeddannelsen er klar, og jo større forstørrelse, jo stærkere fluorescens.
(2) Sådan bruges fluorescensmikroskopet.
1. Tænd for lyskilden, ultrahøjtrykskviksølvlampen skal varmes op i et par minutter for at nå det lyseste punkt.
2. Til transmissionsfluorescensmikroskopet skal det nødvendige excitationsfilter installeres mellem lyskilden og kondensatoren, og det tilsvarende blokeringsfilter skal installeres bag objektivlinsen. Epi-fluorescensmikroskoper skal indsætte det påkrævede excitationsfilter/dobbeltfarvestråledeler/blokerende filterindsats i spalterne i lysbanen.
3. Observer med en linse med lav forstørrelse, og juster midten af lyskilden i henhold til indstillingsanordningen på forskellige typer fluorescensmikroskoper, så den er placeret i midten af hele belysningspunktet.
4. Placer prøvearket og observer efter fokusering. Vær opmærksom under brug: Observer ikke direkte med endefilteret, for ikke at forårsage skade på øjnene; ved observation af prøven med en olielinse skal der anvendes en speciel olielinse uden fluorescens; efter at højtrykskviksølvlampen er slukket, kan den ikke tændes igen med det samme, og den skal testes. Den kan genstartes efter 5 minutter, ellers vil den være ustabil og påvirke kviksølvlampens levetid.
(3) Observation Ved at bruge et blåviolet lysfilter under et fluorescerende mikroskop på undervisningsplatformen kan det ses, at cellerne farvet med o,01 procent acridin orange fluorescerende farvestof, spændes kernen og cytoplasmaet til at producere to forskellige farver af fluorescens (mørke) grøn og orange-rød).
