Principper for konfokal mikroskopi
Konfokalmikroskop er et højpræcisionsbilleddannelsesinstrument, der opstod og udviklede sig i 1980'erne, og er et væsentligt videnskabeligt forskningsinstrument til at studere submikronstrukturer. Med udviklingen af computere, billedbehandlingssoftware og lasere har konfokale mikroskoper også gennemgået en stor udvikling, og bliver nu meget brugt inden for biologi, mikrosystemer og materialemåling. Konfokalmikroskop er en ny type mikroskop, der integrerer konfokalprincip, scanningsteknologi og computergrafikbehandlingsteknologi. Dens vigtigste fordele er: høj lateral opløsning og høj aksial opløsning og effektiv undertrykkelse af strølys med høj kontrast.
En typisk konfokalmikroskopopsætning er at placere to små huller på det konjugerede plan af det målte objekts brændplan, hvoraf det ene er placeret foran lyskilden og det andet er placeret foran detektoren, som vist i figuren 1. Det kan ses af figuren, at når den målte prøve er i kvasi-fokusplanet, er lysintensiteten opsamlet af detektionsenden den største; når den målte prøve er i ude af fokus-position, diffunderer lyspletten ved detektionsenden, og lysintensiteten falder hurtigt. Derfor er det kun det lys, der udsendes af punkter på brændplanet, der kan passere gennem udgangsnålehullet, mens lyset, der udsendes af punkter uden for brændplanet, defokuseres på udgangsnåleplanet, og de fleste af dem kan ikke passere gennem det centrale nålehul. Derfor virker observationsmålpunktet på brændplanet lyst, og ikke-observationspunktet ser sort ud som baggrunden, hvilket øger kontrasten og rydder billedet. Under billeddannelsesprocessen er de to nålehuller konfokale, det konfokale punkt er det detekterede punkt, og det plan, hvor det detekterede punkt er placeret, er det konfokale plan.
Størrelsen af pinhole ved detektoren i konfokal mikroskopi spiller en kritisk rolle. Det påvirker direkte opløsningen og signal-til-støj-forholdet i systemet. Hvis nålehullet er for stort, opnås den konfokale detektionseffekt ikke, hvilket ikke kun reducerer systemets opløsning, men også introducerer mere strølys; hvis nålehullet er for lille, vil det reducere detektionseffektiviteten og reducere det mikroskopiske billede. lysstyrke. Undersøgelser har vist, at når diameteren af nålehullet er lig med diameteren på Airy-skiven, er de konfokale krav opfyldt, og detektionseffektiviteten reduceres ikke væsentligt. Da diameteren af nålehullet generelt er i størrelsesordenen mikron, vil der opstå signalforvrængning, hvis der er en afvigelse mellem laserstrålens fokuspunkt og nålehullets position. Derfor bruger konfokale mikroskoper generelt et autofokussystem, som nærmest øger måletiden.
Da det laserkonfokale scanningsmikroskop er en punktafbildning, er det nødvendigt at bruge todimensional scanning i x- og y-retningerne for at opnå et todimensionalt billede af objektet. Forskellige mikroskoper bruger forskellige scanningsmetoder:
(1) Objektscanning. Det vil sige, at selve objektet bevæger sig efter en bestemt lov, mens lysstrålen forbliver uændret. Fordele: stabil optisk vej; Ulemper: et stort scanningsbord er påkrævet, så scanningshastigheden er stærkt begrænset.
(2) Et strålescanningssystem er dannet ved at bruge et reflekterende galvanometer. Det vil sige, at ved at styre scanningsgalvanometeret reflekteres den fokuserede lysplet regelmæssigt til et bestemt lag af objektet for at fuldføre todimensionel scanning. Dens fordel er, at den har høj præcision og ofte bruges til højpræcisionsmåling. Scanningshastigheden er forbedret i forhold til objektscanning, men den er stadig ikke hurtig.
(3) Brug det akusto-optiske afbøjningselement til scanning, og scanningen realiseres ved at ændre lydbølgens udgangsfrekvens og derefter ændre lysbølgens transmissionsretning. Dens enestående fordel er, at scanningshastigheden er meget hurtig. Scanningssystemet udviklet af USA bruger en akusto-optisk deflektor til at generere videobilleder i realtid. Det tager kun 1/30s at scanne et todimensionalt billede, og det opnår næsten realtidsoutput.
(4) Nipkow disk scanning. Scanningsprocessen afsluttes ved at dreje Nipkow-disken, mens andre komponenter holdes stille. Det kan afbildes på én gang, og hastigheden er meget høj. Men da billedstrålen er lys uden for aksen, skal linsens off-akse aberration korrigeres, og udnyttelsesgraden af lysenergi er meget lav.
