Principper for konfokal lasermikroskopi (LSCM)
Et konfokalt lasermikroskop bruger et belysningsnålhul placeret bag lyskilden og et detekteringsnålhul placeret foran detektoren for at opnå punktbelysning og punktdetektering. Lys fra lyskilden fokuseres på et punkt i prøvens brændplan af lys, der udsendes gennem belysningsnålehullet, og fluorescens, der udsendes fra dette punkt, afbildes i detektionsnålehullet, og ethvert udsendt lys uden for dette punkt blokeres af detektion af nålehul. Belysningsnålehullet og detektionsnålehullet er konjugerede for det belyste eller detekterede punkt, således at det detekterede punkt er det konfokale punkt, og det plan, hvor det detekterede punkt er placeret, er det konfokale plan. Computeren viser det detekterede punkt på computerskærmen i form af et billedpunkt. For at producere et komplet billede, scanner et scanningssystem i den optiske vej hen over prøvens brændplan og producerer således et komplet konfokalt billede. Så længe bæretrinet flyttes op og ned langs Z-aksen, flyttes et nyt niveau af prøven til det konfokale plan, og det nye niveau af prøven afbildes på monitoren, mens Z-aksen fortsætter med at bevægelse, opnås successive lysskårne billeder af forskellige niveauer af prøven.
Det traditionelle optiske mikroskop bruger en feltlyskilde, billedet af hvert punkt på prøven vil blive forstyrret af diffraktion eller spredning af lys fra de tilstødende punkter; laser scanning konfokalmikroskop bruger en laserstråle gennem det oplyste nålehul til at danne en punktlyskilde på prøven scannet ved hvert punkt i det indre brændplan, prøven på det bestrålede punkt, billeddannelsen af detektionsnålehullet ved påvisning af nålehul efter punkt-for-lys multiplikationsrør (PMT) eller kold elektrokoblet enhed (cCCD) Modtaget punkt-for-punkt eller linje-for-linje, dannes der hurtigt et fluorescerende billede på computerskærmen. Belysningsnåle og detektionsnålehul i forhold til objektivlinsens brændplan er konjugeret, punktet på brændplanet er samtidig fokuseret på belysningsnålehullet og emissionsnålehullet, punktet uden for brændplanet vil ikke være i detekteringen af pinhole ved billeddannelsen, så det opnåede konfokale billede er prøvens optiske tværsnit, hvilket overvinder manglerne ved det almindelige mikroskopbillede fuzzy.
Fra det grundlæggende princip er laserkonfokalmikroskop et moderne optisk mikroskop, det er det almindelige lysmikroskop fra teknologien til at lave følgende forbedringer.
1. Brug laser som lyskilde, fordi laserens monokromaticitet er meget god, bølgelængden af lyskildestrålen er den samme, hvilket fundamentalt eliminerer den kromatiske aberration.
2. Brugen af konfokal teknologi i fokusplanet af objektivlinsen placeret i midten med et lille hul i skærmen, brændplanet uden for det vildfarne lys blokerer, hvilket eliminerer den sfæriske aberration; og yderligere eliminere den kromatiske aberration.
3. Laserkonfokalmikroskop ved hjælp af punktscanningsteknologi til at nedbryde prøven i to- eller tredimensional rum i utallige punkter med en meget lille laserstråle (punktlyskilde) punkt for punkt, linje for linje scanningsbilleddannelse og derefter gennem mikrocomputerkombinationen af et helt plan eller tredimensionelt billede. Det traditionelle lysmikroskop er en feltlyskilde under engangsbilleddannelsen, prøver på hvert punkt af billedet vil støde op til punktet med diffrakteret lys og spredt lysinterferens. Klarheden og præcisionen af disse to billeder kan ikke sammenlignes.
4. Opsamling og behandling af optiske signaler med en computer og forstærkning af signalerne med et fotomultiplikatorrør
I det konfokale lasermikroskop erstatter computeren det menneskelige øje eller kamera til observation og videooptagelse, og de opnåede billeder digitaliseres og kan bearbejdes i computeren for at forbedre billedernes klarhed igen. Desuden kan brugen af fotomultiplikatorrør forstærke meget svage signaler, hvilket i høj grad forbedrer følsomheden. Som et resultat af den kombinerede brug af ovennævnte teknologier kan det siges, at LSCM er det mest avancerede mikroskop i verden. Det kan siges, at LSCM er kombinationen af mikroskopproduktionsteknologi, fotoelektrisk teknologi, computerteknologi **, er det uundgåelige produkt af udviklingen af moderne teknologi.
