Krav til prøveforberedelse til fluorescensmikroskopi
Krav til klargøring af prøve til fluorescensmikroskopi
(1) Glasglas
Tykkelsen af diasglasset skal være mellem 0.8-L2 mm. Et objektglas, der er for tykt, vil absorbere mere lys på den ene side og kan på den anden side ikke fokusere excitationslyset på prøven. Slides skal være glatte, ensartede i tykkelse og fri for tydelig autofluorescens. Nogle gange bruges kvartsglas.
(2) Dækglas
Tykkelsen af dækglasset er ca. 0.17 mm, glat. For at forstærke excitationslyset kan der også bruges et interferensdækglas, som er et specielt dækglas belagt med flere lag af stoffer (såsom magnesiumfluorid), der har forskellige interferenseffekter på lys af forskellige bølgelængder, hvilket kan gøre at fluorescens glat. Excitationslys ledes igennem, og excitationslyset reflekteres, og dette reflekterede excitationslys kan excitere prøven.
(3) Prøve
Vævsskiver eller andre prøver må ikke være for tykke. Hvis tykkelsen er for tyk, vil det meste af excitationslyset blive forbrugt i den nederste del af prøven, mens den øverste del, som direkte observeres af objektivlinsen, ikke kan exciteres helt. Desuden påvirker fluorescens forårsaget af overlappende celler eller urenheder, uspecifik baggrundsfarvning vurderingen.
(4) spejlolie
Ved observation af prøver med mørkfeltsfluorescensmikroskoper og olieimmersionsmikroskoper skal der generelt anvendes immersionsolie. Det er bedst at bruge speciel ikke-fluorescerende immersionsolie. Glycerin kan også bruges i stedet, og flydende paraffin kan også bruges, men brydningsindekset er lavt, hvilket har en lille indvirkning på billedkvaliteten.
Forståelse af lysterningen af fluorescensmikroskopi
Fluorescens er det lys, som elektroner i et stof absorberer lysenergi fra en lavenergitilstand til en højenergitilstand, og derefter frigiver lys, når det vender tilbage til en lavenergitilstand. Det er ikke-temperaturudstrålet lys - luminescens. Det vil sige: Stoffet absorberer kortbølget lys, går ind i en exciteret tilstand og udsender langbølget lys.
Uanset om det er stoffets autofluorescens, det fluorescerende farvestof eller det fluorescerende protein udtrykt ved fusion, skal det exciteres af en specifik bølgelængde af lys (Excitation). Efter at elektronerne migrerer og taber energi, udsender de lys med en bestemt lang bølgelængde (emission). , som kan opsamles af detektionssystemet for at opnå funktionen med at identificere specifik fluorescens.
Hvad er en fluorescerende lysterning?
Ved fluorescensmikroskopobservation og billeddannelse tilvejebringes excitationslyset med specifik bølgelængde og det tilsvarende langbølgelængde emissionslys af fluorescenslysterningen, så fluorescenssignalet kan opsamles med det blotte øje, skærm eller kamera. Derfor bestemmer fluorescenslysterningen, hvad der kan detekteres. Nøgleanordningen for fluorescenssignalet, dets karakteristika omfatter EX: excitationsbølgelængdefilterparametre, EM: emissionsbølgelængdefilterparametre og DM: dikotome spejlparametre. Tag DAPI lysterningen fra Revolve integreret fluorescensmikroskop som et eksempel, EX: 385/30, EM: 450/50, DM: 425.
The light emitted by the light source passes through DAPI EX to obtain excitation light in a specific wavelength range, that is, light of 385±15nm, which specifically excites fluorescent substances that can only be excited within this range; the DM dichroic mirror separates the excitation light from the fluorescence Optical elements, as special mirrors, reflect only specific wavelengths of light and allow all other wavelengths to pass through, so only >425nm lys kan transmitteres til EM; EM-emissionsfiltre bruges til at adskille fluorescensen udsendt af fluoroforen fra andre optiske baggrundselementer til at separere lys. Emissionsfiltre transmitterer lys ved fluorescensbølgelængden gennem det dikroiske spejl, mens de blokerer alt andet lys, der lækker fra excitationslyskilden (reflekteret fra prøven eller optikken). Den udsendte lysbølgelængde er større end EM, der skal observeres, det vil sige, at kun lys inden for området 450±25nm kommer ind i detektionssystemet. Korrekt valg af EX-, EM-filtre og DM-dikotomier kan hjælpe forskere med at opnå højere signal-til-støj-forhold (S/N).
