Farvningsteknikker og mikroskopisk observation af mikroorganismer
Enkel farvning af bakterier
1 Mål
1.1 At lære de grundlæggende teknikker til mikrobiel udstrygning og farvning.
1.2 At mestre den enkle farvningsmetode for bakterier.
1.3 At lære bakteriers morfologiske karakteristika at kende, og at konsolidere indlæringen af brugen af oliespejl og aseptiske operationsteknikker.
2 Princip Udstrygning og farvning af bakterier er en grundlæggende teknik i mikrobiologiske forsøg. Bakteriecellerne er små og gennemsigtige, de er ikke nemme at genkende under det almindelige lysmikroskop, og de skal farves. Brugen af et enkelt farvestof til at farve bakterierne, så den farvede organisme og baggrunden danner en klar farveforskel, så deres morfologi og struktur kan iagttages tydeligere. Denne metode er nem at udføre og er velegnet til observation af organismens generelle form og bakteriernes arrangement. Alkaliske farvestoffer bruges almindeligvis til simpel farvning, fordi bakterieceller i neutrale, alkaliske eller svagt sure opløsninger normalt er negativt ladede, og når alkaliske farvestoffer ioniseres, er farvningsdelen af deres molekyler positivt ladet, så farvningsdelen af alkaliske farvestoffer kan nemt binde sig til bakterierne for at få bakterierne til at farve. De farvede bakterieceller står i skarp kontrast til baggrunden og er nemmere at genkende under mikroskopet. Almindeligvis anvendte farvestoffer til simpel farvning omfatter merocyaninblå, krystalviolet og basisk forbindelse rød. Når den bakterielle nedbrydning af sukker til at producere syre, så pH af mediet falder, den positive ladning af bakterierne stiger, og derefter kan bruges i rød, sur rød eller Congo rød og andre sure farvestoffer farvning. Bakterierne skal fikseres inden farvning. Dens formål er todelt: det ene er at dræbe bakterierne og få bakterierne til at hæfte sig til objektglasset; det andet er at øge dets affinitet for farvestoffet. To metoder er almindeligt anvendt: opvarmning og kemisk fiksering. Forsøg at bevare den oprindelige morfologi af cellerne, når de fikseres.
3 materialer
3.1 Stamme Bacillus subtilis 12-18h næringsagar-skråkultur, Staphylococcus aureus ca. 24 timers næringsagar-skråkultur, Escherichia coli 24-timers næringsagar-skråkultur, bagegær-agar-skråkultur.
3.2 Farv Lues alkaliske methylenblå farve (eller ammoniumoxalat krystal violet farve), carbolsyreforbindelse rød plet.
3.3 Instrumenter eller andet tilbehør Mikroskop, alkohollampe, objektglas, podningsring, objektglasholder, dobbeltlagsflaske (fyldt med cederolie og xylen), mikroskoppapir, fysiologisk saltvand eller destilleret vand mv.
4 Fremgangsmåde Udstrygning → tørring → fiksering → farvning → vask → tørring → mikroskopisk undersøgelse.
5 trin
5.1 udstrygning Tag to rene og oliefri objektglas, hver med en lille dråbe saltvand (eller destilleret vand) i midten af objektglasset under aseptiske forhold, med en inokuleringsring til aseptisk at betjene henholdsvis fra Bacillus subtilis, Garcinia micrococcus og Escherichia coli skrå for at plukke lidt mos i dråben vand, blandet og belagt med en film. Hvis bakteriesuspensionen (eller flydende kultur) udstryger, kan bruges til at inokulere ringen pick 2 til 3 ringe direkte på objektglasset. Bemærk, at saltvand (destilleret vand) og tage bakterierne bør ikke være for meget og spredt jævnt, ikke for tyk.
5.2 Tørring Tør naturligt ved stuetemperatur. Den kan også tørres ved at varme lidt op over en spritlampe med den coatede side opad. Men kom ikke for tæt på flammen, fordi temperaturen er for høj vil ødelægge bakteriernes morfologi.
5.3 Fiksering Hvis der anvendes varmetørring, kombineres fiksering og tørring i et enkelt trin på samme måde som tørring. Smør, tør og varmefiks.
5.4 Farvning Placer objektglasset fladt på objektglashylden, tilsæt 1 til 2 dråber farvningsopløsning på udstrygningen (farvningsopløsningen dækker lige udstrygningsfilmen er passende). Farv udstrygningen med Lü's Basic Mellanox Blue i 1~2min og med Carbonate Red (eller Ammonium Oxalat Crystal Violet) i ca. 1 min.
5.5 Skylning Hæld farvningsopløsningen fra og skyl forsigtigt med postevand fra den ene ende af objektglasset, indtil vandet, der løber ned fra udstrygningen, er farveløst. Lad ikke vandet strømme direkte for at vaske den coatede overflade under skylning. Vandstrømmen bør ikke være for hurtig eller for stor for at undgå, at udstrygningsfilmen løsnes.
5.6 Tørring Ryst vanddråberne af på objektglasset for at tørre naturligt, føntørring eller absorberende papir kan bruges til at absorbere tørt (pas på ikke at tørre bakterielegemet af). 5.7 Mikroskopisk undersøgelse Udstrygningen tørres og undersøges ved mikroskopi. Udstrygningen skal være helt tør, før den kan observeres med et oliemikroskop.
6 Resultater Tegn morfologien af E. coli og Micrococcus garciniae efter enkelt farvning.
Gram farve
1 Formål
1.1 At forstå princippet om Gram-farvning og dets betydning for klassificering og identifikation af bakterier.
1.2 At lære og mestre Gram-farvningsteknikken og at konsolidere indlæringen af brugen af lysmikroskopets olielinse.
