Farvningsteknikker og mikroskopisk observation af mikroorganismer
1. Formål
1.1 Lær de grundlæggende teknikker til mikrobielle udstrygninger og farvning.
1.2 Mestre den enkle farvningsmetode for bakterier.
1.3 Foreløbig forstå bakteriers morfologiske karakteristika og konsolidere viden om, hvordan man bruger olielinser og aseptiske operationsteknikker.
2 Principper
Udtværing og farvning af bakterier er en grundlæggende teknik i mikrobiologiske forsøg. Bakterieceller er små og gennemsigtige, hvilket gør dem svære at identificere under et almindeligt lysmikroskop; de skal være farvede. Et enkelt farvestof bruges til at farve bakterier, så de farvede bakterier danner en tydelig farveforskel fra baggrunden, så deres morfologi og struktur kan iagttages tydeligere. Denne metode er nem at betjene og egnet til at observere bakteriecellernes generelle form og bakteriearrangementet. Grundlæggende farvestoffer bruges almindeligvis til simpel farvning. Det skyldes, at i neutrale, alkaliske eller svagt sure opløsninger er bakterieceller normalt negativt ladede, og når basiske farvestoffer ioniseres, er den farvende del af deres molekyler positivt ladet, så de er alkaliske. Den farvende del af farvestoffet kombineres let med bakterier for at farve dem. De farvede bakterieceller står i skarp kontrast til baggrunden, hvilket gør dem nemmere at identificere under et mikroskop. Farvestoffer, der almindeligvis anvendes til simpel farvning, omfatter methylenblåt, krystalviolet, basisk fuchsin osv. Når bakterier nedbryder sukker og producerer syre, hvilket får dyrkningsmediets pH-værdi til at falde, øges den positive ladning på bakterierne. På dette tidspunkt kan sure farvestoffer såsom eosin, sur fuchsin eller Congo rød bruges til farvning. Bakterier skal fikseres før farvning. Det har to formål: det ene er at dræbe bakterier og få dem til at klæbe til glasset; den anden er at øge deres affinitet for farvestoffer. To almindeligt anvendte metoder er opvarmning og kemisk fiksering. Når du fikserer, skal du prøve at bevare den oprindelige form af cellerne.
3 materialer
3.1 Bakterier: Bacillus subtilis 12-18h næringsagar-skråkultur, Staphylococcus aureus 24-timers næringsagar-skråkultur, Escherichia coli 24-timers næringsagar-skråkultur, bagegær-agar-skråkultur.
3.2 Farvemiddel: Lu's alkaliske methylenblåt farvestof (eller ammoniumoxalat krystalviolet farvestof), carbolsyrefuchsinfarvestof.
3.3 Instrumenter eller andre redskaber: mikroskop, alkohollampe, objektglas, inokulationsløkke, objektglasstativ, dobbeltlagsflaske (indeholdende cederolie og xylen), linsevæv, fysiologisk saltvand eller destilleret vand osv.
4. Proces: udstrygning → tørring → fiksering → farvning → vask → tørring → mikroskopisk undersøgelse.
5 trin
5.1 Udstrygning: Tag to rene og oliefrie glasobjektglas. Under sterile forhold anbringes en lille dråbe normal saltvand (eller destilleret vand) på hvert center af glasset. Brug en inokulationsløkke til at sterilisere bakterierne fra Bacillus subtilis. , Micrococcus luteus og Escherichia coli, pluk en lille bakterieplæne i vanddråberne på skrå, bland godt og påfør det til en tynd film. Hvis du bruger en bakteriesuspension (eller flydende kultur) smøre, kan du bruge en inokuleringsløkke til at vælge 2 til 3 løkker og påføre dem direkte på objektglasset. Pas på ikke at tabe for meget fysiologisk saltvand (destilleret vand) og fjern bakterier og påfør det jævnt og ikke for tykt.
5.2 Tørring Tør naturligt ved stuetemperatur. Du kan også varme den lidt over en spritlampe med den coatede side opad for at tørre den. Men sørg for ikke at komme for tæt på flammen, da for høj temperatur vil ødelægge bakteriernes morfologi.
5.3 Fiksering Hvis der anvendes opvarmet tørring, kombineres fiksering og tørring i et trin, og metoden er den samme som tørring. Smør, tør og varmefiks.
5.4 Farvning: Placer objektglasset fladt på objektglasstativet, og tilsæt 1 til 2 dråber farvestofopløsning på udstrygningen (det er passende, at farveopløsningen lige dækker udstrygningsfilmen). Farv med Lu's basiske methylenblå i 1 til 2 minutter, og farv med carbolsyrefuchsin (eller ammoniumoxalat krystalviolet) i ca. 1 minut.
5.5 Vask med vand: Hæld farveopløsningen fra og skyl forsigtigt med postevand fra den ene ende af objektglasset, indtil vandet, der løber ned fra udstrygningen, er farveløst. Når du vasker med vand, må du ikke vaske den coatede overflade direkte med vand. Vandstrømmen må ikke være for hurtig eller for stor for at forhindre, at smørefilmen falder af.
5.6 Tørring: Ryst vanddråberne af på objektglasset og tør naturligt, føntør med en hårtørrer eller absorber det med absorberende papir (pas på ikke at tørre bakterierne af). 5.7 Mikroskopisk undersøgelse Efter udstrygningen er tør, udføres mikroskopisk undersøgelse. Udstrygningen skal være helt tør før visning med en olielinse.
6 Resultater Tegn morfologien af E. coli og Micrococcus luteus observeret efter enkelt farvning.
