Forskellen mellem (to-foton, konfokalt) fluorescensmikroskop og almindeligt mikroskop
Det grundlæggende princip for to-foton-excitation er, at fluorescerende molekyler ved høj fotondensitet samtidig kan absorbere to lange bølgelængde fotoner og udsende en kortere bølgelængde-foton efter en kort periode med såkaldt ophidset statslige levetid; Effekten er den samme som at bruge en foton med halvdelen af bølgelængden af den lange bølgelængde for at begejstre fluorescerende molekyler. To foton-excitation kræver en høj fotontæthed, og for at undgå at beskadige celler bruger to-fotonmikroskopi højenergi-tilstandslåste pulslasere. Den laser, der udsendes af denne laser, har høj spidsenergi og lav gennemsnitlig energi med en pulsbredde på kun 100 femtosekunder og en frekvens på op til 80 til 100 megahertz. Når man bruger en høj numerisk blændeobjektivlinse til at fokusere fotonerne af en pulseret laser, forekommer fototætheden ved omdrejningspunktet for den objektive linse den højeste, og to-foton-excitation forekommer kun ved omdrejningspunktet for objektivlinsen. Derfor kræver det to-fotonmikroskop ikke et konfokalt pinhole, hvilket forbedrer effektiviteten af fluorescensdetektion.
Generelt fluorescensfænomener på grund af den lave fotontæthed af excitationslyset kan et fluorescerende molekyle kun absorbere en foton ad gangen og derefter udsende en anden fluorescerende foton gennem strålende overgang, der er kendt som enkelt fotonfluorescens. Til fluorescens-excitationsprocesser ved anvendelse af lasere som lyskilder kan der forekomme to-foton eller endda multiphoton-fluorescensfænomener. I dette tilfælde har den anvendte excitationslyskilde høj intensitet og fotondensitet, der opfylder kravet om fluorescerende molekyler til at absorbere to fotoner samtidig. I processen med at anvende en generel laser som excitationslyskilde er fotondensiteten stadig utilstrækkelig til at producere to-fotonabsorptionsfænomen. Typisk anvendes femtosekundpulslasere, hvor øjeblikkelig effekt når megawatt -niveauet. Derfor er bølgelængden af to-foton-fluorescens kortere end for excitationslys, svarende til den virkning, der er produceret af halv excitationsbølgelængde-excitation.
Viden relateret til konfokal fluorescensmikroskopi
Det grundlæggende princip om konfokal fluorescensmikroskopi er at bruge en punktlyskilde til at bestråle prøven og danne en veldefineret lille lysplads på fokusplanet. Fluorescensen, der udsendes fra dette sted efter bestråling, er opsamlet af den objektive linse og sendt tilbage langs den originale bestrålingsvej til bjælkeplitteren sammensat af et dikroisk spejl. Spektrometeret sender fluorescens direkte til detektoren. Der er et pinhole foran både lyskilden og detektoren, kaldet belysningspinhul og detektionspinhole. De geometriske dimensioner af de to er konsistente, cirka 100-200 nm; Sammenlignet med det lette sted på fokusplanet er de to konjugerede, hvilket betyder, at lysplettet passerer gennem en række linser og i sidste ende kan fokusere på både belysningspinhul og detektionspinhul samtidigt. På denne måde kan lys fra fokalplanet konvergere inden for detektionshullets interval, mens spredt lys ovenfra eller under fokusplanet blokeres uden for detektionshullet og kan ikke afbildes. Scanning af prøvepunktet for punkt med en laser, det fotomultiplikatorrør efter at have påvisning af pinhullet opnår også det tilsvarende konfokale billede af det lette pletpunkt for punkt, konverterer det til et digitalt signal og overfører det til computeren, og til sidst aggregerer det til et klart konfokalt billede af hele fokusplanet på skærmen.
