Den vigtigste observationsmetode for optisk mikroskop er fluorescensobservation
Fluorescens fænomen
Fluorescens refererer til den proces, hvor et fluorescerende stof udsender lys med en længere bølgelængde næsten samtidigt, når det bestråles med lys af en bestemt bølgelængde (figur 1). Når lys med en bestemt bølgelængde (excitationsbølgelængde) rammer et molekyle (såsom et molekyle i en fluorofor), absorberes fotonenergien af molekylets elektroner. Dernæst går elektronerne over fra grundtilstanden (S0) til et højere energiniveau, den exciterede tilstand (S1'). Denne proces kaldes excitation①. Elektronen forbliver i den exciterede tilstand i 10-9–10-8 sekunder, hvorunder elektronen mister noget energi ②. I processen med at forlade den exciterede tilstand (S1) og vende tilbage til grundtilstanden ③, vil den resterende energi, der absorberes under excitationsprocessen, blive frigivet.
Opholdstiden for et fluorescerende molekyle i den exciterede tilstand er fluorescenslevetiden, generelt i nanosekunder, hvilket er en iboende karakteristik af selve det fluorescerende molekyle. Teknologien til billeddannelse ved hjælp af fluorescenslevetid kaldes Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), som kan udføre mere dybdegående funktionelle og nøjagtige målinger ud over fluorescensintensitetsbilleddannelse for at opnå molekylær konformation, intermolekylære interaktioner og molekylære mikromiljøer. information, der er svær at få med konventionel optisk billeddannelse.
En anden vigtig egenskab ved fluorescens er Stokes-skiftet, forskellen i bølgelængde mellem excitations- og emissionstoppene (figur 2). Normalt er emissionslysbølgelængden længere end excitationslysbølgelængden. Dette skyldes, at efter at det fluorescerende stof er exciteret og før fotonen frigives, vil elektronerne miste en del af energien gennem afslapningsprocessen. Fluorescerende stoffer med større Stokes-skift er nemmere at observere under et fluorescensmikroskop.
Fluorescensmikroskoper og fluorescensfilterblokke
Fluorescensmikroskopi er et optisk mikroskop, der bruger fluorescensegenskaber til at observere og afbilde, og er meget udbredt inden for cellebiologi, neurobiologi, botanik, mikrobiologi, patologi, genetik og andre områder. Fluorescensbilleddannelse har fordelene ved høj sensitivitet og høj specificitet og er meget velegnet til observation af fordelingen af specifikke proteiner, organeller osv. i væv og celler, studiet af co-lokalisering og interaktion og sporing af livsdynamik processer såsom ændringer i ionkoncentration.
De fleste molekyler i celler fluorescerer ikke, og for at se dem skal de være fluorescerende mærket. Der er mange metoder til fluorescerende mærkning, som kan mærkes direkte (såsom brug af DAPI til at mærke DNA) eller immunfarvning ved hjælp af antistoffers antigenbindende egenskaber, eller målproteinet kan mærkes med fluorescerende proteiner (såsom GFP, grønt) fluorescerende protein) eller reversibel binding. syntetiske farvestoffer (såsom Fura-2) osv.
På nuværende tidspunkt er fluorescensmikroskopet blevet standardbilledudstyret i forskellige laboratorier og billeddannelsesplatforme, og det er en god hjælper til vores daglige eksperimenter. Fluorescensmikroskoper er hovedsageligt opdelt i tre kategorier: opretstående fluorescensmikroskoper (egnede til sektionering), inverterede fluorescensmikroskoper (egnede til levende celler, under hensyntagen til snit), fluorescerende stereoskopiske mikroskoper (velegnet til større prøver, såsom planter, zebrafisk (voksne/voksne) embryo), medaka, mus/rotteorganer osv.).
Fluorescensfilterblokken er kernekomponenten i fluorescensbilleddannelse i mikroskoper. Den består af et excitationsfilter, et emissionsfilter og en dikroisk stråledeler. Den er installeret i filterhjulet, såsom Leica DMi8 udstyret med et 6-positionsfilterhjul (Figur 3). ). Forskellige mikroskoper har forskellige hjulpositioner, og nogle mikroskoper bruger filterglas.
Filterblokken spiller en vigtig rolle i fluorescensbilleddannelse: excitationsfilteret vælger excitationslyset til at excitere prøven og blokerer andre bølgelængder af lys; lyset, der passerer gennem excitationsfilteret, passerer gennem en dikroisk strålesplitter (dets rolle er at reflektere excitationslyset og transmittere fluorescensen), Efter refleksion fokuseres det af objektivlinsen, bestråles til prøven, og den tilsvarende fluorescens exciteres til udsende lys. Det udsendte lys opsamles af objektivlinsen, passerer gennem den dikroiske stråledeler og når emissionsfilteret. Som vist i figur 4: excitationsbølgelængden er 450-490nm, den dikroiske stråledeler reflekterer lys kortere end 510nm, transmitterer lys længere end 510nm, og emissionslysmodtagelsesområdet er 520-560nm.
Fluorescensfiltre, der almindeligvis anvendes i fluorescensmikroskoper, kan opdeles i to typer: langpas (LP for kort) og båndpas (BP for kort). Båndpasset bestemmes normalt af den centrale bølgelængde og intervallets bredde, såsom 480/40, hvilket betyder, at lys fra 460-500nm kan passere. Langpasfiltre, såsom 515 LP, passerer lys med bølgelængder længere end 515 nm (figur 5).
Fluorescerende stoffer har deres karakteristiske excitation (absorption) kurve og emissionskurve, excitationstoppen er den ideelle excitationsbølgelængde (høj excitationseffektivitet, som kan reducere excitationslysenergien, beskytte celler og farvestoffer), og emissionskurven er emissionsfluorescensbølgelængden rækkevidde. Derfor vil vi i eksperimentet vælge bølgelængden så tæt på excitationstoppen som muligt for excitation, og modtageområdet skal inkludere emissionstoppen. For eksempel er excitationsspidsen for Alexa Fluor 488 500nm, og excitationsfilteret på 480/40 kan vælges i fluorescensmikroskopet.
Detaljer om filterterningerne kan ses i mikroskopbilleddannelsessoftwaren. At forstå farvestoffer og finde det filter, der bedst matcher din prøve, er afgørende for fluorescensbilleddannelse. Den spektrale information om fluorescerende farvestoffer og fluorescerende proteiner er generelt angivet i instruktionerne og kan også findes online.
Ud over excitations- og emissionsbølgelængderne af fluorescerende prober skal udvælgelsen af filterblokke også overveje, om der er ikke-specifik excitation, og om der er krydsfarve for flerfarvemærkede prøver. Derudover er det nødvendigt at overveje den anvendte fluorescerende lyskilde. På nuværende tidspunkt omfatter de almindeligt anvendte fluorescerende lyskilder kviksølvlamper, metalhalogenlamper og LED-lyskilder, der har udviklet sig hurtigt i de senere år. Spektret af en fluorescerende lyskilde er kontinuerligt eller diskontinuerligt, og energien vil være forskellig i forskellige bølgelængdebånd. LED-lyskilde er gradvist ved at blive den vigtigste lyskilde for fluorescensmikroskop på grund af dets relativt smalle spektralbånd, mere stabil energiudgang, lang levetid, sikrere og miljøbeskyttelse og mange andre fordele.
Ud over den indbyggede filterblok i mikroskopet er der også et eksternt hurtighjul (Figur 7). Konverteringshastigheden for filteret, der støder op til Leicas eksterne hurtighjul, er 27ms, hvilket kan realisere højhastigheds flerfarveeksperimenter, såsom FRET og Fura2 ratio calcium billeddannelse. (fig. 8) et al.
En bred vifte af fluorescensmikroskopi billeddannelsesteknikker
For at imødekomme forskellige fluorescensbilleddannelsesbehov er der udover fluorescensmikroskoper udviklet forskellige fluorescensmikroskopibilledløsninger:
Wide-field high-definition billeddannelsessystemer, såsom Leica THUNDER Imager, bruger Leicas innovative Clearing-teknologi til effektivt at fjerne ikke-brændplansinterferenssignaler under billeddannelse, og præsenterer klare billeder og fordelene ved højhastighedsbilleddannelse;
Det konfokale laserscanningsmikroskop bruger pinholes til at eliminere ikke-brændplansinterferens, realiserer optisk sektionering og opnår billeder i høj opløsning og tredimensionelle billeder;
Mikroskoper med ultrahøj opløsning og nanomikroskoper, der bryder igennem diffraktionsgrænsen, kan observere fine strukturer mindre end 200 nm;
Et multifoton billeddannelsessystem, der anvender princippet om multifoton excitation til billeddannelse af tykt væv og dybt in vivo;
Light sheet imaging-teknologi med høj tidsmæssig og rumlig opløsning, hurtig billeddannelseshastighed, høj opløsning, lav fototoksicitet, især velegnet til forskning i udvikling og in vivo dynamisk observation;
Fluorescenslivstidsbilleddannelse (FLIM), som ikke påvirkes af faktorer som fluorescerende stofkoncentration, fotoblegning, excitationslysintensitet osv., kan udføre mere dybtgående funktionelle og nøjagtige målinger;
Fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) og fluorescenskrydskorrelationsspektroskopi (FCCS), måler molekylærtallet og diffusionskoefficienten for fluorescerende molekyler og analyserer derved molekylær koncentration, molekylstørrelse, viskositet, molekylær bevægelse, molekylær binding/dissociation og molekylære optiske egenskaber;
Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRF), med ekstrem høj z-akseopløsning, er ideel til at studere cellemembranoverfladers molekylære struktur og dynamik.
