Der er to typer fluorescensmikroskoper med hensyn til deres optiske veje:
1. Transmissionsfluorescensmikroskop: Excitationslyskilden bruges til at excitere fluorescens ved at passere gennem prøvematerialet gennem en kondensatorlinse. Almindelig anvendte mørkefeltskoncentratorer kan også bruges, og almindelige koncentratorer kan bruges til at justere reflektoren for at omdirigere og sidesløjfe excitationslyset på prøven. Dette er et relativt gammeldags-fluorescensmikroskop. Dens fordel er stærk fluorescens ved lav forstørrelse, men dens ulempe er, at dens fluorescens falder med stigende forstørrelse. Derfor er det bedre at observere større prøvematerialer.
2. Faldende lys fluorescensmikroskop er en ny type fluorescensmikroskop udviklet i moderne tid. I modsætning til ovenstående falder excitationslyset fra objektivlinsen nedad på overfladen af prøven ved at bruge den samme objektivlinse som belysningskondensatoren og objektivlinsen til opsamling af fluorescens. En dobbeltfarvet stråledeler skal tilføjes til den optiske vej, som er 45 grader fra det lette uran. Vinkel, excitationslyset reflekteres ind i objektivlinsen og fokuseres på prøven. Fluorescensen, der genereres af prøven, såvel som excitationslyset, der reflekteres fra overfladen af objektivlinsen og dækglasset, kommer ind i objektivlinsen og vender tilbage til dobbeltfarvestråledeleren, hvorved excitationslyset og fluorescensen adskilles. Det resterende excitationslys absorberes derefter af blokeringsfilteret. Hvis der anvendes forskellige kombinationer af excitationsfiltre/dobbelt farvestråleseparatorer/blokeringsfiltre, kan de opfylde behovene for forskellige fluorescerende reaktionsprodukter. Fordelene ved dette fluorescensmikroskop er ensartet feltbelysning, klar billeddannelse og stærkere fluorescens med større forstørrelse.
