To-foton fluorescensmikroskopi har mange fordele:
1) Længere bølgelængder af lys påvirkes mindre af spredning end kortere bølgelængder af lys for at trænge ind i prøven;
(2) Fluorescerende molekyler uden for brændplanet exciteres ikke, så mere excitationslys kan nå brændplanet, så excitationslyset kan trænge dybere ind i prøven;
3) Længere bølgelængder af nær-infrarødt lys er mindre giftige for celler end kortere bølgelængder;
4) Når du bruger et to-fotonmikroskop til at observere en prøve, er fotoblegning og fototoksicitet kun til stede i brændplanet. Derfor er to-fotonmikroskoper mere velegnede end enkeltfotonmikroskoper til at observere tykke prøver, til at observere levende celler eller til at udføre pletfotoblegningsforsøg.
Konfokal fluorescensmikroskop viden
Det grundlæggende princip for konfokalt fluorescensmikroskop: en punktlyskilde bruges til at bestråle prøven, der danner et lille, veldefineret lyspunkt på brændplanet. Den fluorescens, der udsendes fra dette punkt efter bestråling, opsamles af objektivlinsen og sendes tilbage til stråledeleren, der består af et tovejs kromatisk spejl langs den oprindelige bestrålingslysbane. Strålesplitteren sender fluorescensen direkte til detektoren. Både lyskilden og detektoren har hver et nålehul foran sig, kaldet henholdsvis belysningsnålhullet og detektionsnålehullet. Begge har den samme geometri, ca. 100-200 nm, og er konjugerede med hensyn til lyspunktet på brændplanet, dvs. lyspunktet passerer gennem en række linser og kan i sidste ende fokuseres på både den lysende og detektornålehuller. På denne måde kan lys fra fokalplanet konvergere inden for sondeåbningen, mens spredt lys fra oven eller under brændplanet blokeres uden for sondeåbningen og ikke kan afbildes. Laseren scanner prøven punkt for punkt, og fotomultiplikatorrøret opnår efter detektering af pinhole også det konfokale billede af det tilsvarende lys punkt for punkt, som omdannes til et digitalt signal og transmitteres til computeren og til sidst konvergerer til en klar konfokalt billede af hele brændplanet på skærmen.
Hvert brændplansbillede er faktisk et optisk tværsnit af prøven, og dette optiske tværsnit har altid en vis tykkelse, også kendt som et optisk ark. Da lysintensiteten ved brændpunktet er meget større end i ikke-brændpunktet, og lyset i ikke-brændplanet filtreres ud af nålehullet, anslås dybdeskarpheden af det konfokale system til at være nul, og scanning langs Z-aksens retning gør det muligt for optisk tomografi at danne en todimensional optisk skive af prøven, der skal observeres ved brændpunktet. Ved at kombinere XY-plan (brændplan) scanning med Z-akse (optisk akse) scanning, kan et tredimensionelt billede af prøven opnås ved at akkumulere successive lag af todimensionelle billeder, som behandles af specialiseret computersoftware.
Det betyder, at detektionsnålehullet og lyskildenålhullet altid er fokuseret på samme punkt, således at fluorescens exciteret uden for brændplanet ikke kan trænge ind i detektionsnålehullet.
Arbejdsprincippet for laserkonfokal er ganske enkelt udtrykt, at det bruger laser som lyskilde, på grundlag af traditionel fluorescensmikroskop-billeddannelse, yderligere laserscanningsenhed og konjugeret fokuseringsenhed, gennem computerstyring til at udføre digital billedoptagelse og behandlingssystem.
