Forståelse af konfokal fluorescensmikroskopi
Det grundlæggende princip for konfokal fluorescensmikroskopi: Brug en punktlyskilde til at belyse prøven for at danne en lille, veldefineret lysplet på brændplanet. Fluorescensen, der udsendes af stedet efter at være blevet belyst, opsamles af objektivlinsen og returneres til det dikroiske spejl langs den oprindelige belysningslysbane. udgøre en stråledeler. Spektrometret sender fluorescensen direkte til detektoren. Der er et nålehul foran lyskilden og detektoren, som kaldes henholdsvis belysningsnålhullet og detektionsnålehullet. De geometriske dimensioner af de to er konsistente, ca. 100-200nm; i forhold til lyspunktet på brændplanet er de to konjugerede, det vil sige, lyspunktet passerer gennem en række linser og kan i sidste ende fokuseres på belysningsnålehullet og detektionsnålehullet på samme tid. På denne måde kan lyset fra brændplanet koncentreres inden for detektionshullets rækkevidde, mens det spredte lys fra oven eller under brændplanet blokeres uden for detektionshullet og ikke kan afbildes. Prøven scannes punkt for punkt med laseren, og fotomultiplikatorrøret bag detektionsnålhullet opnår også punkt for punkt det konfokale billede af det tilsvarende lys, som omdannes til et digitalt signal og transmitteres til computeren og til sidst aggregeres på skærmen til et klart konfokalt billede af hele brændplanet. .
Hvert brændplansbillede er faktisk et optisk tværsnit af prøven. Dette optiske tværsnit har altid en vis tykkelse og kaldes også et optisk tyndt snit. Da lysintensiteten ved fokus er meget større end lysintensiteten ved ikke-fokus, og lyset i ikke-fokalplanet filtreres af nålehullet, er dybdeskarpheden af det konfokale system omtrentlig nul. Scanning langs Z-aksens retning kan realisere optisk tomografi, hvilket danner den ønskede. Observer den todimensionelle optiske sektion på det fokuserede sted af prøven. Ved at kombinere XY-plan (brændplan) scanning med Z-akse (optisk akse) scanning, ved at akkumulere kontinuerlige niveauer af todimensionelle billeder og behandle dem med specialiseret computersoftware, kan et tredimensionelt billede af prøven opnås.
Det vil sige, at detektionsnålehullet og lyskildenålhullet altid er fokuseret på det samme punkt, således at fluorescensen exciteret uden for fokusplanet ikke kan trænge ind i detektionsnålehullet.
Det enkle udtryk for arbejdsprincippet for laserkonfokal er, at den bruger laser som lyskilde. På basis af traditionel fluorescensmikroskopafbildning tilføjes en laserscanningsenhed og en konjugatfokuseringsenhed, og systemet styres af en computer til at indsamle og behandle digitale billeder.
