Hvad er to-foton fluorescensmikroskopi
Grundprincippet for to-foton excitation er: i tilfælde af høj fotondensitet kan fluorescerende molekyler absorbere to langbølgede fotoner på samme tid og udsende en kortere bølgelængde foton efter en kort periode med såkaldt exciteret tilstandslevetid . ; effekten er den samme som at bruge en foton, hvis bølgelængde er halvdelen af den lange bølgelængde til at excitere et fluorescerende molekyle. To-foton excitation kræver en høj foton tæthed. For ikke at beskadige celler bruger to-fotonmikroskopi højenergi-moduslåste pulserende lasere. Laseren, der udsendes af denne laser, har høj spidsenergi og lav gennemsnitsenergi, dens pulsbredde er kun 100 femtosekunder, og dens frekvens kan nå 80 til 100 megahertz. Når du bruger en objektivlinse med høj numerisk blænde til at fokusere fotonerne i den pulserende laser, er fotondensiteten ved objektivlinsens brændpunkt den højeste, og to-foton-excitationen sker kun ved objektivlinsens brændpunkt, så to-foton-mikroskopet behøver ikke et konfokalt nålehul, hvilket forbedrer effektiviteten af fluorescensdetektion.
I almindelige fluorescensfænomener kan et fluorescerende molekyle på grund af excitationslysets lave fotondensitet kun absorbere én foton på samme tid og derefter udsende en fluorescerende foton gennem en strålingsovergang, som er enkeltfotonfluorescens. Til fluorescensexcitationsprocessen, der anvender laser som lyskilde, kan to-foton eller endda multi-foton fluorescens forekomme. På dette tidspunkt er intensiteten af den anvendte excitationslyskilde høj, og fotondensiteten opfylder kravene til fluorescerende molekyler, der absorberer to fotoner på samme tid. I processen med at bruge en generel laser som excitationslyskilde er fotondensiteten stadig ikke nok til at producere to-fotonabsorptionsfænomenet. Normalt bruges en femtosekund pulseret laser, og dens øjeblikkelige effekt kan nå størrelsesordenen megawatt. Derfor er bølgelængden af to-foton fluorescens kortere end bølgelængden af excitationslys, hvilket svarer til den effekt, der frembringes af excitation ved halvdelen af excitationsbølgelængden.
