Sammenligning og egenskaber af fluorescensmikroskoper og konventionelle optiske mikroskoper
Et fluorescensmikroskop adskiller sig fra et almindeligt optisk mikroskop. I stedet for at observere prøver under belysning fra en konventionel lyskilde, bruger den lys med en specifik bølgelængde (normalt ultraviolet eller blåviolet lys) til at excitere fluorescerende stoffer i prøven, hvilket får dem til at udsende fluorescens. Derfor tjener lyskilden i et fluorescensmikroskop ikke til direkte belysning; det fungerer som en energikilde til at excitere endogene fluorescerende stoffer i prøven. Vi er i stand til at observere prøven ikke på grund af belysning fra kilden, men på grund af den fluorescens, der udsendes af de fluorescerende stoffer i prøven efter at have absorberet excitationslyset.
Det følger heraf, at nøgleegenskaben ved et fluorescensmikroskop er dets lyskilde, som kan levere rigeligt excitationslys inden for et specifikt bølgelængdeområde for at give tilstrækkelig excitationsintensitet for de fluorescerende stoffer i testprøven. I mellemtiden skal et fluorescensmikroskop være udstyret med et tilsvarende filtersystem. Som et væsentligt værktøj til fluorescenshistokemi består det hovedsageligt af en ultrahøjtrykslyskilde, et filtersæt (inklusive excitationsfiltre og barrierefiltre), et optisk system og et fotografisk system. Det virker ved at ophidse prøver med lys af en vis bølgelængde for at producere fluorescens.
Fluorescensexcitationsmetoder: Klassificeret efter bølgelængdeområde i UV-excitation (ultraviolet belysningsmetode) og BV-excitation (blå-violet lysmetode). UV-excitation bruger nær-ultraviolet lys kortere end 400 nm til excitation. Intet synligt excitationslys er involveret, så den observerede fluorescens viser farvestoffets iboende fluorescens. Dette gør det nemt at skelne specifik fluorescens på prøven fra autofluorescens af baggrundsvævet.
BV excitationsmetode: Excitation udføres med lys, der spænder fra ultraviolet til blåt lys, centreret ved 404 nm og 434 nm. Da blåt lys bestråler prøven i denne metode, skal afskæringsfilteret i fluorescensobservationssystemet fuldstændigt blokere blåt lys, mens det fuldt ud transmitterer den nødvendige grønne og gule fluorescens. Denne metode anvendes på fluorochromer, der anvendes i fluorescerende antistofteknikker. Den maksimale absorptionsbølgelængde af excitationslyset og den maksimale emissionsbølgelængde af fluorescensen er relativt tæt på hinanden, så der kræves skarpe filtre til BV-excitation. Blåt lys bruges her som excitationslys, hvilket giver høj absorptionseffektivitet af fluorokromer og giver lysere billeder. Dens ulempe er, at fluorescens under 500 nm ikke kan detekteres, og signaler over 500 nm giver hele billedet en gul farvetone. I fluorescerende antistofassays bedømmes specificiteten for det meste ud fra den karakteristiske farve af fluorokromet. Når man vurderer subtil specificitet, kan ovennævnte ulempe ved BV-excitationsmetoden derfor have en betydelig indvirkning.
