Forskelle mellem fluorescensmikroskoper og almindelige lysmikroskoper
Fluorescensmikroskoper adskiller sig fra konventionelle optiske mikroskoper. I stedet for at observere prøver med lys fra en almindelig lyskilde, bruger de lys af en specifik bølgelængde (normalt ultraviolet eller blåviolet lys) til at excitere fluorescerende stoffer i prøven på objektglasset, hvilket får disse stoffer til at udsende fluorescens. Derfor belyser lyskilden i et fluorescensmikroskop ikke direkte prøven; det fungerer som en energikilde til at excitere de endogene fluorescerende stoffer i prøven. Vi kan se prøven ikke på grund af belysning fra selve lyskilden, men fordi de fluorescerende stoffer inde i prøven absorberer excitationslysenergien og udsender derefter fluorescens.
Det følger heraf, at nøgleegenskaben ved et fluorescensmikroskop er, at dets lyskilde kan levere excitationslys af et specifikt bølgelængdebånd, hvilket gør det muligt for de fluorescerende stoffer i den inspicerede prøve at udsende fluorescens af tilstrækkelig intensitet. I mellemtiden skal et fluorescensmikroskop være udstyret med et tilsvarende filtersystem. Det er et vigtigt instrument til fluorescenshistokemi. Et fluorescensmikroskop består hovedsageligt af en lyskilde med ultrahøjt tryk, et filtersystem (inklusive excitationsfiltre og barrierefiltre), et optisk system og et fotografisk system. Det virker ved at bruge lys af en bestemt bølgelængde til at excitere fluorescerende stoffer.
① Metoder til fluorescensexcitation I henhold til bølgelængdeområdet for excitationslyset er der to typer: UV-excitationsmetode (ultraviolet belysningsmetode) og BV-excitationsmetode (blåviolet belysningsmetode). UV-excitationsmetoden bruger ultraviolet lys, der er kortere end 400 nm til excitation. Det genererer usynlig fluorescens, så den observerede fluorescens kommer fra selve prøven. Denne metode skelner let specifik fluorescens fra autofluorescens af baggrunden.
② BV excitationsmetode BV excitationsmetoden bruger excitationslys, der spænder fra violet til blåt centreret ved 404 nm og 434 nm. Da blåt lys bruges til at bestråle prøven, skal excitationsfiltersystemet til denne metode fuldstændigt blokere blåt lys og kun tillade det nødvendige grønne og gule lys at passere igennem. For fluorescerende antistoffarvning er den maksimale absorptionsbølgelængde af excitationslyset tæt på den maksimale emissionsbølgelængde for det fluorescerende farvestof. Af denne grund skal filtersættet til BV excitation bruge et afskæringsbarrierefilter. Denne metode bruger blåt lys til excitation, så fluorescensopsamlingseffektiviteten er relativt høj, og lysere billeder kan opnås. Dens ulempe er, at fluorescens over 500 nm ikke kan detekteres, og kun gul-grønne billeder kan ses over 500 nm. Ved fluorescerende antistoffarvning afhænger bedømmelse af specificitet i høj grad på farveinformation, så ulempen ved BV-excitationsmetoden kan være en væsentlig begrænsning, når man diskuterer subtil specificitet.
