Funktioner og sammenligning af fluorescensmikroskop og konventionelt optisk mikroskop
Et fluorescensmikroskop adskiller sig fra et almindeligt optisk mikroskop. I stedet for at belyse prøven med almindelige lyskilder, bruger den lys af en bestemt bølgelængde (normalt ultraviolet eller blåviolet lys) til at excitere fluorescerende stoffer inde i prøven for at udsende fluorescens. Lyset fra lyskilden bruges ikke til direkte belysning, men tjener som excitationsenergi for det fluorescerende stof. Derfor kan vi observere prøven ikke på grund af belysning fra lyskilden, men på grund af den fluorescens, der udsendes, efter at de fluorescerende stoffer i prøven absorberer excitationslyset. Det følger heraf, at nøgleegenskaben ved et fluorescensmikroskop er, at dets lyskilde skal levere excitationslys af en specifik bølgelængde, hvilket gør det muligt for fluorescensstoffet at fluorescerende stof nok i fluorescensen. intensitet. I mellemtiden skal et fluorescensmikroskop være udstyret med et dedikeret filtersystem. Fluorescensmikroskopet er et grundlæggende instrument til immunfluorescenshistokemi. Den består hovedsageligt af en lyskilde med ultrahøjt tryk, filtersæt (inklusive excitations- og barrierefiltre), et optisk system og understøttende komponenter. Den bruger lys med en bestemt bølgelængde til at excitere fluoroforer.
Der er to excitationstilstande klassificeret efter bølgelængdeområde: UV-excitationsmetoden (ultraviolet bestrålingsmetode) og BV-excitationsmetoden (blå-violet excitationsmetode).
UV-excitationsmetode: Nær-ultraviolet lys kortere end 400 nm anvendes til excitation. Der findes ikke noget synligt excitationslys i denne metode. Den observerede fluorescens viser den iboende fluorescens af farvestoffet, hvilket gør det nemt at skelne specifik fluorescens på prøven fra autofluorescens af baggrundsvævet.
BV excitationsmetode: Excitation udføres med lys centreret ved 404 nm og 434 nm, varierende fra ultraviolet til blåviolet. Blåt lys bestråler prøven i denne metode. Derfor skal fluorescensobservationssystemets barrierefilter fuldstændigt blokere blåt lys, mens det transmitterer den påkrævede grønne og gule fluorescens. Det bruges til fluorokromer i immunfluorescensassays. Da den maksimale absorptionsbølgelængde af fluorochromet er tæt på excitationsbølgelængden af BV-metoden, kan blåt lys bruges som excitationslyset, hvilket resulterer i høj lysabsorptionseffektivitet af fluorochromet og relativt klare billeder. Dens ulempe er, at fluorescens ved bølgelængder under 500 nm ikke kan observeres, og kun fluorescenssignaler over 500 nm kan vises på billedet. I immunfluorescensassays identificeres fluorokromer delvist ved deres farve. Derfor, når subtil specificitet diskuteres, har ovenstående ulempe ved BV-excitationsmetoden en betydelig indvirkning.
