Fluorescensmikroskop relateret viden
Det grundlæggende princip for konfokal fluorescensmikroskopi: en punktlyskilde bruges til at bestråle prøven, og en veldefineret lille lysplet dannes på brændplanet. sammensat af splittere. Strålesplitteren sender fluorescensen direkte til detektoren. Der er et nålehul foran lyskilden og detektoren, henholdsvis kaldet belysningsnålhullet og detektionsnålehullet. Den geometriske størrelse af de to er den samme, ca. 100-200nm; i forhold til lyspletten på brændplanet, er de to konjugerede, det vil sige, at lyspletten passerer gennem en række linser og til sidst kan fokuseres på belysningsnålehullet og detektionsnålehullet på samme tid. På denne måde kan lyset fra brændplanet konvergeres inden for detektionshullets omfang, mens det spredte lys fra oven eller under brændplanet blokeres uden for detektionshullet og ikke kan afbildes. Laseren scanner prøven punkt for punkt, og fotomultiplikatorrøret efter detektering af nålehullet opnår også det konfokale billede af det tilsvarende lys punkt for punkt, som omdannes til et digitalt signal og transmitteres til computeren og til sidst aggregeres til en klar konfokalt billede af hele brændplanet på skærmen.
Hvert brændplansbillede er faktisk et optisk tværsnit af prøven, og dette optiske tværsnit har altid en vis tykkelse, også kendt som et optisk tyndt snit. Da lysintensiteten ved brændpunktet er meget større end ved ikke-fokuspunktet, og lyset i ikke-fokusplanet filtreres af nålehullet, er dybdeskarpheden af det konfokale system omtrentlig nul, og scanning langs Z -aksen kan realisere optisk tomografi, der danner en Observer den todimensionelle optiske sektion på det fokuserede sted af prøven. Ved at kombinere XY-plan (brændplan) scanning med Z-akse (optisk akse) scanning, kan det tredimensionelle billede af prøven opnås ved at akkumulere todimensionale billeder af kontinuerlige lag og behandles af speciel computersoftware.
Det vil sige, at detektionsnålehullet og lyskildenålhullet altid er fokuseret på det samme punkt, således at fluorescensen exciteret uden for brændplanet ikke kan trænge ind i detektionsnålehullet.
Det enkle udtryk for arbejdsprincippet for laserkonfokal er, at den bruger laserlys som lyskilde. På basis af traditionel fluorescensmikroskop-billeddannelse tilføjer den en laserscanningsenhed og en konjugeret fokuseringsenhed, og det er et system til digital billedoptagelse og -behandling gennem computerstyring.
