Hvordan fluorescensmikroskopi adskiller sig fra konventionel mikroskopi
Jeg forsøgte for nylig at lave nogle frosne snit af mus, og nu skal jeg bruge et fluorescensmikroskop for at se, om den virus, jeg injicerede, er i det ønskede hjerneområde. Nogle grundlæggende principper for fluorescensmikroskopi skal studeres kort, og jeg vil også dele dem her.
Fluorescensmikroskop bruger ultraviolet lys som lyskilde til at belyse objektet, der testes, hvilket får objektet til at udsende en lyskilde og derefter observere objektet under mikroskopet. Det bruges hovedsageligt til immunfluorescensceller og er sammensat af en lyskilde, filterpladesystem og optisk system til at observere fluorescensbilledet af prøven gennem forstørrelse af okularet og objektivlinsen. Lad os tage et kig på forskellen mellem dette fluorescensmikroskop og et almindeligt optisk mikroskop.
1. Med hensyn til belysningsmetoder
Lysmetoden i et fluorescensmikroskop bruger generelt en faldende strålemetode, hvilket betyder, at lyskilden projiceres på testprøven gennem objektivlinsen.
2. Med hensyn til opløsning
Fluorescensmikroskopi bruger ultraviolet lys som lyskilde med en relativt kort bølgelængde, men højere opløsning end almindelige optiske mikroskoper.
3. Forskelle på filteret
Et fluorescensmikroskop bruger to specielle filtre, det ene foran lyskilden til at bortfiltrere synligt lys, og det andet mellem objektivet og okularet til at bortfiltrere ultraviolet lys, som kan beskytte øjnene.
Fluorescensmikroskopi er også en type optisk mikroskop, primært fordi bølgelængden exciteret af fluorescensmikroskopi er kort, hvilket fører til forskelle i strukturen og anvendelsen af fluorescensmikroskopi og almindelig mikroskopi. De fleste fluorescensmikroskoper har en god funktion til at fange svagt lys, så deres billeddannelsesevne er også god under ekstremt svag fluorescens. Derudover er støjen med den løbende forbedring af fluorescensmikroskopi i de senere år også blevet væsentligt reduceret. Derfor anvendes flere og flere fluorescensmikroskoper.
Viden relateret til to-foton fluorescensmikroskopi
Grundprincippet for to-foton excitation er, at fluorescerende molekyler ved høj fotondensitet samtidigt kan absorbere to lange bølgelængde fotoner og efter en kort periode med såkaldt exciteret tilstands levetid udsende en kortere bølgelængde foton; Dens virkning er den samme som at bruge en foton med en bølgelængde på halvdelen af den lange bølgelængde til at excitere fluorescerende molekyler. To-foton-excitation kræver en høj foton-densitet, og for at undgå at beskadige celler, bruges en højenergi-mode-låst pulslaser i et to-foton-mikroskop. Laseren udsendt af denne type laser har høj spidsenergi og lav gennemsnitsenergi med en pulsbredde på kun 100 femtosekunder og en frekvens på op til 80 til 100 megahertz. Når du bruger et objektiv med høj numerisk blændeåbning til at fokusere fotonerne i en pulserende laser, er fotondensiteten i objektivets brændpunkt den højeste, og to-foton excitation forekommer kun ved objektivets brændpunkt. Derfor kræver et to-fotonmikroskop ikke konfokale nålehuller, hvilket forbedrer effektiviteten af fluorescensdetektion.
I almindelige fluorescensfænomener kan et fluorescerende molekyle på grund af excitationens lave fotondensitet kun absorbere en foton på samme tid og derefter udsende en fluorescerende foton gennem strålingsovergang, som kaldes single photon fluorescens. Til fluorescensexcitationsprocessen, der anvender laser som lyskilde, kan to-foton eller endda multifoton fluorescens fænomener forekomme. På dette tidspunkt er den anvendte excitationslyskilde af høj intensitet, og fotondensiteten opfylder kravet om, at fluorescerende molekyler absorberer to fotoner samtidigt. I processen med at bruge en typisk laser som excitationslyskilde er fotondensiteten stadig ikke tilstrækkelig til at generere to-fotonabsorptionsfænomen. Typisk bruges femtosekund-pulslasere, og deres øjeblikkelige effekt kan nå niveauet af megawatt. Derfor er bølgelængden af to-foton fluorescens kortere end excitation, hvilket svarer til effekten produceret af halv excitationsbølgelængde excitation.
