Hvordan man vælger det passende fluorescensmikroskop
Fluorescensmikroskop er et standard mikroskopisk billeddannelsesudstyr i laboratorier og patologiske afdelinger, som bruger fluorescensegenskaber til observation og billeddannelse. Det er meget udbredt inden for forskellige områder såsom cellebiologi, neurobiologi, botanik, mikrobiologi, patologi, genetik osv. Fluorescensbilleddannelse har fordelene ved høj sensitivitet og specificitet, hvilket gør det meget velegnet til at observere fordelingen af specifikke proteiner, organeller osv. i væv og celler, studerer co-lokalisering og interaktioner, sporing af livsdynamiske processer såsom ionkoncentrationsændringer og så videre.
Valg af mikroskoper
Fluorescensmikroskoper er hovedsageligt opdelt i tre kategorier: opretstående fluorescensmikroskoper (velegnede til udskæring), inverterede fluorescensmikroskoper (velegnede til levende celler og også til udskæring) og stereofluorescensmikroskoper (velegnet til større prøver, såsom planter, zebrafisk (voksne fisk) embryonale), medaka, mus/rotteorganer osv.).
Valg af fluorescerende filterblokke
Udvælgelsen af filterblokke bør ikke kun overveje excitations- og emissionsbølgelængderne af fluorescerende prober, men også overveje, om der er ikke-specifik excitation, og om der er farvekrydstale for flerfarvemærkede prøver. I eksperimentet vil vi vælge den bølgelængde, der er tættest på excitationstoppen, så meget som muligt til excitation, og modtageområdet bør omfatte topemissionen. Excitationstoppen for Alexa Fluor 488 er 500nm, og et 480/40 excitationsfilter kan vælges i et fluorescensmikroskop. De almindeligt anvendte fluorescerende filterblokke i fluorescensmikroskopi kan opdeles i to typer: langpas (LP) og båndpas (BP), som også skal vælges efter behov.
Konfokalt mikroskop
I traditionelle fluorescensmikroskopiobservationer er de på grund af overlapningen af fluorescerende mærkede stoffer og spontane fluorescensstrukturer tæt bundet sammen. Men traditionelle faldende fluorescensmikroskopiobjektiver samler ikke kun lys fra brændplanet, men spreder også lys op og ned i brændplanet, hvilket resulterer i en betydelig reduktion i billedopløsning og kontrast.
Konfokal billeddannelse detekterer kun lyset, der reflekteres fra selvfokuseringsplanet, og løser dermed ovenstående problem. Lyskilden danner en lille og fin plet på brændplanet gennem et nålehul, og lyset, der udsendes fra brændplanet, opsamles gennem objektivlinsen. Størstedelen af fluorescensen udsendt fra punkter over eller under objektivlinsens brændplan kan ikke konvergere til nålehullet. Kun fluorescensen placeret i brændplanet og en lille del af defokuseret fluorescens kan passere gennem pinhole, mens lysstrålen uden for fokalplanet konvergerer foran eller bag pinhole pladen og er blokeret fra at komme ind i detektoren gennem pinhole. Det detekterede billede er fra brændplanet, så den endelige billedkvalitet er væsentligt forbedret.
På grund af de forskellige fordele og praktiske ved laserscanning konfokal mikroskopi er det i øjeblikket en uundværlig eksperimentel assistent inden for højpræcisionscellebiologi, botanik og celleforskningsfelter. Samtidig vil det i fremtidige videnskabelige forskningscentre være det mest grundlæggende og centrale forskningsværktøj.
