Viden relateret til konfokal fluorescensmikroskopi
Det grundlæggende princip for konfokal fluorescensmikroskopi er at bruge en punktlyskilde til at bestråle prøven, der danner en veldefineret lille plet på brændplanet. Den fluorescens, der udsendes af stedet efter bestråling, opsamles af objektivlinsen og sendes tilbage til spektrofotometeret, der består af et tovejs farvespejl langs den oprindelige bestrålingsbane. Spektrofotometeret sender fluorescens direkte til detektoren. Der er to pinholes foran lyskilden og detektoren, henholdsvis kaldet illumination pinholes og detection pinholes. De geometriske dimensioner af de to er konsistente, ca. 100-200nm; Sammenlignet med lyspunktet på brændplanet er de to konjugerede, hvilket betyder, at lyspunktet passerer gennem en række linser og i sidste ende kan fokusere på både belysningsnålehullet og detektionsnålehullet samtidigt. På denne måde kan lys fra brændplanet konvergere inden for detektionshullets rækkevidde, mens spredt lys fra oven eller under brændplanet blokeres uden for detektionshullet og ikke kan afbildes. Ved at scanne prøven punkt for punkt med en laser, opnår fotomultiplikatorrøret efter detektering af pinhole også det tilsvarende konfokale billede af lyset punkt for punkt, som omdannes til et digitalt signal og transmitteres til computeren. Til sidst syntetiseres et klart konfokalt billede af hele brændplanet på skærmen.
Hvert brændplansbillede er faktisk et optisk tværsnit af prøven, som altid har en vis tykkelse, også kendt som et optisk tyndt snit. På grund af det faktum, at lysintensiteten ved brændpunktet er meget større end ved ikke-brændpunktet, og lyset i ikke-brændplanet er filtreret ud af nålehuller, er dybdeskarpheden af det konfokale system omtrentlig nul. Scanning langs Z-aksens retning kan opnå optisk tomografi, der danner en todimensional optisk skive ved brændpunktet af den observerede prøve. Ved at kombinere XY-plan (brændplan) scanning med Z-akse (optisk akse) scanning, kan et tredimensionelt billede af prøven opnås ved at akkumulere kontinuerlige lag af todimensionelle billeder og behandle dem med specialiseret computersoftware.
Detektionsnålehullet og lyskildenålhullet er altid fokuseret på det samme punkt, således at fluorescens exciteret uden for fokuseringsplanet ikke kan trænge ind i detektionsnålehullet.
Det enkle udtryk for arbejdsprincippet for konfokal lasermikroskopi er, at den bruger en laser som lyskilde og tilføjer en laserscanningsenhed og en konjugeret fokuseringsenhed på basis af traditionel fluorescensmikroskopi-billeddannelse. Det er et system styret af en computer til digital billedoptagelse og -behandling.
