Mikroskopisk billeddannelsesklasseværelse丨Anvendelse af fluorescensmikroskopi
Total intern refleksions fluorescensmikroskopi (TIRFM) er en teknik, der udnytter den forsvindende bølge, der genereres af en lysstråle, der udbreder sig mellem to forskellige brydningsindeksmedier til at sondere overfladen af fluorescerende mærkede levende celler. I praksis, når en indfaldende laserstråle støder på grænsefladen mellem dækglasset og det vandige medium, der indeholder cellerne, reflekteres den ved den kritiske vinkel (total intern refleksion). Fordi energien af den flygtige bølge aftager eksponentielt med afstanden fra dækglasset, er det kun fluoroforer inden for 10 nanometer fra overfladen (mellem 10 og 200 nanometer), der exciteres af den forsvindende bølge, mens fluoroforer længere væk er stort set uexciterede. Påvirket. Således resulterer TIRFM i høje signalniveauer fra fluoroforer placeret nær dækglasset, overlejret på en meget mørk baggrund, hvilket giver et fremragende signal-til-støj-forhold. Den ekstreme begrænsning af excitationsdybden er ideel til at studere enkelte molekyler eller membran- og organelsammensætning i adhærente celler nær dækglasoverfladen (se figur 8(e)). Da excitation er begrænset til tynde områder nær dækglasset, er fotoblegning og fototoksicitet også begrænset til disse regioner, hvilket gør TIRFM til en af de mest nyttige metoder til langtidsobservation. Teknikken er blevet et grundlæggende redskab til at studere en lang række fænomener inden for celle- og molekylærbiologi.
Deconvolution er en algoritme, der anvendes på et sæt af alle-fokus-billeder erhvervet langs den optiske (Z)-akse for at forbedre fotonsignalet i en stak billeder for et givet billedplan eller flere fokalplaner. Mikroskoper skal være udstyret med højpræcisions motoriserede fokusdrev for at garantere billedoptagelse med præcist definerede intervaller mellem prøvens brændplan. I en typisk applikation (se fig. 8(f)) bruges dekonvolutionsprocessen til at udsløre og fjerne ufokuseret lys fra et givet brændplan ved brug af widefield-fluorescensexcitation og -emission. Den mest komplekse applikation er at anvende dekonvolutionsprocessen på hele billedstakken for at generere projicerede visninger eller 3D-modeller. Et sæt widefield-billeder, der bruges til dekonvolution, fanger det teoretiske maksimale antal fotoner, der udsendes af prøven. Dekonvolutionsprocessen omfordeler de "slørede" intensiteter af fotoner udsendt over og under brændplanet tilbage til det oprindelige plan. Deconvolution bruger således næsten alle tilgængelige emissionsintensiteter og giver et optimalt lysbudget, hvilket gør denne teknik til den foretrukne metode til meget lysfølsomme prøver.
En variant af resonansenergioverførselsfænomenet på fluorescensmikroskopi, fluorescens eller Förster resonansenergioverførsel (FRET) bruges til at opnå kvantitativ tidsmæssig og rumlig information om binding og interaktion mellem proteiner, lipider, enzymer og nukleinsyrer i levende celler. FRET kan anvende enten konstant-tilstand eller tidsopløste teknikker, men tidsopløst FRET-billeddannelse har fordelen af mere præcist at kortlægge donor-acceptor-afstande. Et standard widefield fluorescensmikroskop udstyret med passende excitations- og emissionsfiltre og et følsomt kamera kan bruges til FRET-billeddannelse. Biosensorer, der sandwich et miljøfølsomt protein eller peptid mellem to FRET-anvendelige fluorescerende proteiner, er i øjeblikket meget brugt i cellebiologi. Disse prober afbildes let under wide-field fluorescensmikroskopi ved hjælp af sensibiliseret emission FRET teknikker kombineret med ratiometrisk analyse. Derudover kan spektral billeddannelse og lineær unmixing ved hjælp af laserscanning konfokal mikroskopi hjælpe med at overvåge FRET-fænomener i biosensorer og andre fluorescerende proteinapplikationer.
Fluorescenslevetid billeddannelsesmikroskopi (FLIM) er en sofistikeret teknik, der er i stand til samtidigt at registrere fluorescenslevetiden og den rumlige placering af en fluorofor på hvert sted i billedet. Denne metode giver en mekanisme til at studere miljøparametre såsom pH, ionkoncentration, opløsningsmiddelpolaritet, ikke-kovalente interaktioner, viskositet og iltspænding i enkelte levende celler og præsenterer dataene i rumlige og tidsmæssige arrays. FLIM-målinger af eksiterede tilstandslevetider på nanosekundskalaen er uafhængige af lokale fluorophorkoncentrationer, fotoblegningseffekter og vejlængde (prøvetykkelse), men er følsomme over for exciterede tilstandsreaktioner såsom resonansenergioverførsel. Faktisk anses det for at være en af de bedste måder at studere dette fænomen på at kombinere FLIM med FRET ved at overvåge livstidsændringerne af fluorescerende donorer før og efter resonansenergioverførsel.
Mobiliteten (tværgående diffusionskoefficient) af fluorescensmærkede makromolekyler og små fluoroforer kan bestemmes ved fluorescensgenvinding efter fotoblegning (FRAP) teknik. I FRAP er et meget lille udvalgt område (et par mikrometer i diameter) intenst belyst, normalt med en laser, for at frembringe fuldstændig fotoblegning af fluoroforen i det område. Resultatet er en dramatisk reduktion eller udslettelse af fluorescens. Efter en fotoblegningsimpuls blev hastigheden og omfanget af gendannelse af fluorescensintensitet i blegede områder overvåget som en funktion af tid ved lave excitationsintensiteter for at generere information om kinetikken af fluorofor-genpopulation og -genvinding (figur 9). FRAP udføres normalt ved hjælp af EGFP eller andre fluorescerende proteiner. Beslægtede fotoaktiveringsteknikker er baseret på specielle syntetiske bur-fluoroforer eller lignende funktionelle fluorescerende proteiner, der kan aktiveres af korte pulser af UV eller violet. Fotoaktivering og FRAP kan bruges som komplementære teknikker til at bestemme mobilitetsparametre.
I en teknik relateret til FRAP, kaldet fluorescenstab efter fotoblegning (FLIP), gennemgår et defineret fluorescerende område i en levende celle gentagen fotoblegning ved intens bestråling. Hvis alle fluoroforer var i stand til at diffundere ind i det område, der fotobleges i løbet af den målte periode, ville dette resultere i et fuldstændigt tab af fluorescerende signal i hele cellen. Ved at beregne den hastighed, hvormed fluorescens forsvinder fra hele cellen, kan diffusionsmobiliteten af målfluoroforen bestemmes. Derudover kan FLIP let identificere placeringen og arten af eventuelle diffusionsbarrierer mellem individuelle rum af celler, såsom barrieren mellem soma og axon af en neuron.
Fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS), der hovedsageligt anvendes i laserscanning konfokal mikroskopi eller multifotonmikroskopi, er en metode designet til at bestemme kinetisk information såsom kemiske reaktionshastigheder, diffusionskoefficienter, teknikker til molekylvægt, flowhastighed og aggregering. I FCS belyses et lille volumen (ca. et femtometer; laserens diffraktionsbegrænsede fokus) med en fokuseret laserstråle for at registrere autofluorescensintensitetsfluktuationer induceret af dynamikken af fluorescerende molekyler som en funktion af tiden i volumenet optaget af fluorescens. molekyler (fig. 10). Relativt små fluoroforer diffunderer hurtigt i det oplyste volumen og producerer korte udbrud af tilfældig intensitet. Omvendt bevæger større komplekser (fluoroforer bundet til makromolekyler) sig langsommere og producerer længere, mere vedvarende tidsafhængige fluorescensintensitetsmønstre.
Når fluorescensmærkede strukturer er tæt pakket og overlapper i specifikke områder af levende celler, er deres dynamik og rumlige fordeling vanskelige at analysere. Fluorescenspletmikroskopi (FSM) er en teknik, der er kompatibel med næsten alle billeddannelsesmodaliteter, der udnytter meget lave koncentrationer af fluorescensmærkede underenheder, reducerer ufokuseret fluorescens og forbedrer synligheden af mærkede strukturer og deres dynamik i tykke områder. FSM'er implementeres ved kun at mærke en brøkdel af hele strukturen af interesse. I denne forstand ligner FSM at udføre FCS over hele synsfeltet, selvom det lægger mere vægt på rumlige mønstre i stedet for kvantitativ tidsanalyse. Fluorescerende pletmikroskopi er særlig nyttig til at bestemme mobiliteten og aggregeringen af cytoskeletale elementer såsom actin og mikrotubuli i hyperaktive celler.
Stimuleret emissionsudtømningsmikroskopi (STED) er en ny superopløsningsteknik med rumlig opløsning langt ud over diffraktionsgrænsen, der bruger ringformet udtømt lys til at omgive en mindre stråle af excitationslys for at opnå sub-50 nm på aksen til opløsningen. Teknikken er afhængig af excitation af fluoroforer med synkroniserede laserimpulser og rumligt koordinerede cirkulære STED-impulser, der udtømmer det udsendte lys og undertrykker fluorescens af exciterede molekyler omkring laserscanningsfokuset. Fluorescens genereret i periferien af stedet undertrykkes, men ikke i midten af stedet, hvilket reducerer størrelsen af den fluorescerende plet betydeligt og øger opløsningen tilsvarende betydeligt. STED har vist sig at være et nyttigt værktøj til højopløsningsdetektion af levende celler. Andre nye superopløsningsteknikker, såsom fotoaktiveret lokaliseringsmikroskopi (PALM) og struktureret lysbelysningsmikroskopi (SIM), vil også blive grundlæggende værktøjer til levende cellebilleddannelse i den nærmeste fremtid.
Den stigende brug af genetisk kodede fluorescerende proteiner og avancerede syntetiske fluoroforer til live-celle billeddannelse åbner døren til nye optiske modaliteter til overvågning af tidsmæssig dynamik og rumlige forhold. Mikroskopister har nu et komplet sæt værktøjer til at observere og registrere billeddata af cellulære processer, der finder sted over en lang række tidsskalaer og ved flere opløsninger. Langsommere hændelser kan let observeres og optages ved hjælp af laserscanning konfokalmikroskopi, mens hurtigere kinetiske hændelser kan opnås ved hjælp af spinning disk-teknologi. Derudover muliggør multifotonmikroskopi dyb billeddannelse i tykt væv, og total intern refleksionsteknikker muliggør sondering af membranoverflader med konfokal præcision. Avancerede fluorescensmetoder, såsom FRET, FLIM, FRAP, FCS, FSM, SIM, PALM og STED, kan bruges til at overvåge protein-protein-interaktioner ved opløsninger, der ofte er bedre end dem, der tillades af diffraktionsgrænsen. Med fremskridt inden for fluorofor, mikroskop og detektorteknologi vil en bredere verden blive bragt "under lup".
