Multifotonmikroskopi billeddannelse: forskellige teknikker til billeddannelse af neuroner in vivo
Sammenlignet med det traditionelle enkelt-foton bredfelts fluorescensmikroskop har multifotonmikroskopi (MPM) funktionerne optisk sektionering og dyb billeddannelse. I 2019, Jerome Lecoq et al. diskuteret relateret MPM-teknologi fra tre aspekter: neuronbilleddannelse dybt i hjernen, massiv neuronbilleddannelse og højhastighedsneuronbilleddannelse.
For at forbinde neuronaktivitet med kompleks adfærd, er det normalt nødvendigt at afbilde neuroner i den dybe cortex, hvilket kræver, at MPM har evnen til dyb billeddannelse. Excitations- og emissionslys vil blive meget spredt og absorberet af biologisk væv, hvilket er den vigtigste faktor, der begrænser billeddybden af MPM. Selvom spredningsproblemet kan løses ved at øge laserintensiteten, vil det medføre andre problemer, såsom brænding af prøven, defokusering og fluorescerende excitation nær overfladen. Den bedste måde at øge dybden af MPM-billeddannelse på er at bruge længere bølgelængder som excitationslys.
For to-foton (2P) billeddannelse er ude af fokus og overfladenær fluorescensexcitation de to største dybdebegrænsende faktorer, mens disse to problemer for tre-foton (3P) billeddannelse er stærkt reduceret, men tre-foton billeddannelse på grund af fluorescens Absorptionstværsnittet af gruppen er meget mindre end det af 2P, så der kræves en størrelsesorden højere pulsenergi for at opnå det samme intensitetsfluorescenssignal som det exciterede af 2P. Funktionel 3P mikroskopi er mere krævende end strukturel 3P mikroskopi, som kræver hurtigere scanning for at prøve neuronal aktivitet i tide; højere pulsenergi er påkrævet for at indsamle tilstrækkelige signaler inden for opholdstiden for hver pixel.
Kompleks adfærd involverer ofte store hjernenetværk med både lokale og lang række forbindelser. For at forbinde neuronaktivitet med adfærd er det nødvendigt at overvåge aktiviteten af meget store og vidt udbredte neuroner på samme tid. Det neurale netværk i hjernen behandler indkommende stimuli inden for titusvis af millisekunder. For at forstå dette hurtige neurale netværk For at studere neurons dynamik kræves det, at MPM har evnen til hurtigt at afbilde neuroner. Hurtige MPM-metoder kan opdeles i enkeltstråle-scanningsteknikker og multistråle-scanningsteknikker.
Single-beam scanningsteknologi muliggør højhastighedsgennemgang af neuralt væv med et stort synsfelt (FOV)
Når du bruger MPM til at afbilde neuroner, kan scanning med tilfældig adgang – det vil sige laserstrålen scannes hurtigt på et hvilket som helst valgt punkt i hele synsfeltet – kun scanne de interesserede neuroner, hvilket ikke kun undgår at scanne eventuelle umærkede nervefibre. også optimere scanningstiden for laserstrålen. Random-access scanning (fig. 1) kan opnås med en akusto-optisk deflektor (AOD), som virker ved at forbinde en piezoelektrisk transducer med et radiofrekvenssignal til en passende krystal. De resulterende akustiske bølger inducerer et periodisk brydningsindeksgitter. Diffraktion opstår, når en laserstråle passerer gennem et gitter. Intensiteten og frekvensen af lydbølgen kan justeres ved hjælp af det elektriske radiofrekvenssignal for at ændre intensiteten og retningen af det diffrakterede lys, så en-dimensionel horisontal vilkårlig punktscanning kan realiseres ved at bruge en AOD, og 3D kan realiseres ved at bruge et par AOD'er kombineret med andre aksiale scanningsteknologier random access scanning. Denne teknik er dog meget følsom over for prøvens bevægelse og tilbøjelig til bevægelsesartefakter. På nuværende tidspunkt er hurtig rasterscanning, det vil sige progressiv scanning i FOV, meget udbredt, fordi algoritmen nemt kan løse bevægelsesartefakterne.
AOD-baseret to-foton billeddannelse af neokortikale L2/3 neuroner in vivo[2]
Der er mange måder at realisere hurtig rasterscanning på, ved at bruge et vibrerende spejl til hurtig 2D-scanning, ved at kombinere et vibrerende spejl og en justerbar elektrisk linse til hurtig 3D-scanning, men den justerbare elektriske linse kan ikke hurtigt fokusere i aksial retning på grund af begrænsningen af mekanisk inerti Switching, som påvirker billedhastigheden, kan nu erstattes med en rumlig lysmodulator (SLM).
Fjernfokusering er også et middel til at opnå 3D-billeddannelse, som vist i figur 2. I LSU-modulet scanner scanningsgalvanometeret vandret, og ASU-modulet inkluderer objektivlinsen L1 og spejlet M, og den aksiale scanning realiseres ved at justere positionen af M. Denne teknik kan ikke kun korrigere den optiske aberration introduceret af hovedobjektivet L2, men også muliggøre hurtig aksial scanning. For at opnå mere neuron-billeddannelse kan FOV'en forstørres ved at justere objektivets linsedesign af mikroskopet, men objektivlinsen med stor NA og stor FOV er normalt tung og kan ikke bevæge sig hurtigt til hurtig aksial scanning, så store FOV-systemer er afhængige af Telefocus , SLM og justerbare motoriserede linser.
Skematisk diagram af et fjernfokuserende to-foton billeddannelsessystem[3] Multi-beam scanningsteknologi kan samtidigt afbilde forskellige positioner af neuronalt væv
This technique3 typically uses two independent paths for imaging two distant (>1-2 mm fra hinanden) billeddannelsessteder (fig. 3C,D); for tilstødende områder bruger den normalt flere stråler af en enkelt objektivlinse til billeddannelse (fig. 3E,F). Multi-beam scanningsteknikken skal være særlig opmærksom på krydstaleproblemet mellem excitationsstråler, som kan løses ved post-lyskildeseparationsmetode eller rum-tid multiplekseringsmetode. Post-hoc lyskildeadskillelsesmetoden refererer til brugen af algoritmer til at adskille strålerne for at eliminere krydstale; time-space multiplexing-metoden refererer til den samtidige brug af flere excitationsstråler, hver stråles pulser er forsinket i tid, således at de individuelle stråler exciteret af forskellige stråler midlertidigt kan adskilles. fluorescerende signal. Flere neuroner kan afbildes ved at introducere flere stråler, men flere stråler vil øge overlapningen af fluorescens henfaldstid, hvilket begrænser evnen til at skelne signalkilder; og multipleksing har en negativ indvirkning på elektroniske enheders arbejdshastighed. Høje krav; et stort antal stråler kræver også højere lasereffekt for at opretholde et omtrentligt signal-til-støj-forhold for en enkelt stråle, hvilket let kan føre til vævsskade.
Stort område billeddannelsesteknologi
I de seneste år har udviklingen af forskellige MPM-teknologier udvidet omfanget af vores billeddannelse af neuralt væv, hvilket giver os mulighed for at afbilde flere neuroner dybt inde i hjernen med en hurtigere hastighed, hvilket i høj grad har fremmet neurovidenskabelig forskning og gjort os i stand til at få en klarere forståelse af hjernens funktion.
