Principper for fluorescensmikroskopi
Fluorescensmikroskoper er forskellige fra almindelige optiske mikroskoper. I stedet for at observere prøver under belysning af almindelige lyskilder, bruger de lys af en vis bølgelængde (normalt ultraviolet lys, blå-violet lys) til at excitere de fluorescerende stoffer i prøverne under mikroskopet for at få dem til at udsende fluorescens. Derfor fungerer lyskilden i et fluorescensmikroskop ikke som direkte belysning, men som en energikilde, der exciterer de fluorescerende stoffer i prøven. Grunden til, at vi kan observere prøven, skyldes lyskildens belysning, men fluorescensfænomenet, der præsenteres efter, at det fluorescerende stof i prøven absorberer den exciterede lysenergi.
Det ses, at det karakteristiske ved fluorescensmikroskopet er, at dets lyskilde kan levere en stor mængde excitationslys i et bestemt bølgelængdeområde, således at det fluorescerende stof i den testede prøve kan opnå excitationslyset med den nødvendige intensitet. Samtidig skal fluorescensmikroskopet have det tilsvarende filtersystem.
Fluorescensmikroskopi er et vigtigt værktøj i immunfluorescenshistokemi. Det er sammensat af ultrahøjspændingslyskilde, filtersystem (inklusive excitations- og undertrykkelsesfilterplade), optisk system og fotograferingssystem og andre hovedkomponenter. Den bruger lys af en bestemt bølgelængde til at excitere prøven til at udsende fluorescens.
Måden at excitere fluorescens: Ifølge lysets bølgelængdeområde kan den opdeles i to typer: UV-excitationsmetode (ved hjælp af ultraviolet belysningsmetode) og BV-excitationsmetode (ved brug af blåviolet lys). UV-excitationsmetoden bruger nær-ultraviolet lys kortere end 400nm til excitation. Der er intet synligt excitationslys i denne metode, så den observerede fluorescens præsenterer farvestoffets iboende fluorescens, og det er let at skelne den specifikke fluorescens på prøven fra autofluorescensen i baggrundsvævet.
BV excitationsmetoden er baseret på 404nm og 434nm for excitation fra ultraviolet til blåt lys. Denne metode bruger blåt lys til at bestråle prøven, så afskæringsfilteret i fluorescensobservationssystemet skal bruge et filter, der fuldstændigt kan blokere det blå lys og helt passere den nødvendige grønne og gule fluorescens. Fluorescerende farvestoffer til fluorescerende antistofanalyser. Den maksimale absorptionsbølgelængde for excitationslys er relativt tæt på den maksimale emissionsbølgelængde for fluorescens, så filteret, der anvendes i BV-excitationsmetoden, skal bruge et skarpt afskæringsfilter. Denne metode kan bruge blåt lys som excitationslyset, så absorptionseffektiviteten af det fluorescerende pigment er højere, og et lysere billede kan opnås. Dens ulempe er, at fluorescensen under 500nm ikke kan ses, og fluorescensen over 500nm får hele billedet til at se gult ud. I den fluorescerende antistofmetode bedømmes fluorokromets specificitet ofte ud fra farven, der er unik for fluorokromet. Når man diskuterer subtil specificitet, har de ovennævnte mangler ved BV-excitationsmetoden derfor ofte stor indflydelse.
For at opsummere kan belysningen af fluorescensmikroskopet betragtes i henhold til de følgende tre punkter i henhold til kondensatorens struktur og bølgelængden af excitationslyset.
① Set ud fra kontrastkravene til det fluorescerende billede, bruges UV-excitationsmørkefeltkoncentratoren til belysning.
② I betragtning af billedets lysstyrke har BV excitationsfilter den højeste observationseffektivitet i mørke felter.
③Karakteristikaene for mørkefeltobservation med UV-excitationsfilter og BV-excitationsmørkefeltkoncentratorbelysning kan betragtes som mellem disse to belysningsmetoder, men førstnævnte har stærkere mørkefeltegenskaber og viser lysere billeder. Kontrasten er lille; sidstnævnte bevarer egenskaberne for mørkefelts lysbane, så det viste billede er mørkere, og kontrasten forbedres. Når der rent faktisk anvendes et fluorescensmikroskop, skal den belysningsmetode, der passer bedst til prøvens krav, bruges til observation.
Det skal påpeges, at selvom den UV-exciterede mørkefeltskondensator med den bedste kontrast er belyst, vil en del af det ultraviolette excitationslys, der brydes eller spredes af prøven, komme ind i objektivlinsen. Autofluorescens kan forværre billedresponsen. Derfor skal der bruges et UV-absorberende filter foran okularet som afskæringsfilter.
