At skubbe grænserne for superopløsningsmikroskopi: selvjusterende mikroskopi
Ultra-præcisionsmikroskopi, der går ud over begrænsningerne for det nobelprisvindende superopløsningsmikroskop, vil give forskere mulighed for direkte at måle afstandene mellem individuelle molekyler.
Medicinske forskere ved University of New South Wales har opnået en hidtil uset opløsning i enkeltmolekylemikroskopi for at detektere interaktioner mellem individuelle molekyler i intakte celler.
2014 Nobelprisen i kemi blev tildelt for udviklingen af super-opløsnings fluorescensmikroskopi-teknologi, som gav mikroskopister den første molekylære visning af indersiden af en celle, en funktion, der giver nye molekylære visninger af komplekse biologiske systemer og processer.
Nu er detektionsgrænserne for enkeltmolekylemikroskopi blevet skubbet igen, og detaljer er blevet offentliggjort i det seneste nummer af Science Advances.
Det har været muligt at observere og spore individuelle molekyler med ultrahøjopløsningsmikroskoper, men interaktionerne mellem disse molekyler sker i en skala, der er mindst fire gange mindre end den, der opløses af eksisterende enkeltmolekylemikroskoper.
"Grunden til, at enkeltmolekylemikroskoper typisk har en lokaliseringsnøjagtighed omkring 20 til 30 nanometer er normalt, fordi mikroskopet faktisk bevæger sig, når det detekterer signaler. Dette fører til usikkerhed. Ved at bruge eksisterende superopløsningsinstrumenter kan vi undlade at afgøre, om et protein er bundet til en anden, fordi afstanden mellem dem er kortere end usikkerheden i deres positioner."
For at løse dette problem byggede holdet en automatiseret feedback-loop inde i enkeltmolekylemikroskopet, der detekterer og justerer den optiske vej og spejlstadiet.
"Det er lige meget, hvad du gør med dette mikroskop, det finder i bund og grund returvejen med nanometerpræcision. Det er et smart mikroskop. Det kan alt, hvad en operatør eller serviceingeniør skal gøre, og det kan det 12 gange i sekundet. " sagde prof. Goss.
Måling af afstanden mellem proteiner
Med det design og den metodologi, der er beskrevet i dette papir, har UNSW-teamet designet et feedback-system, der er kompatibelt med eksisterende mikroskoper og giver maksimal fleksibilitet til prøveforberedelse.
"Dette er en meget enkel og elegant løsning på et stort billeddannelsesproblem. Vi har lige bygget et mikroskop inde i et mikroskop, og alt, hvad vi gjorde, var at justere hovedmikroskopet. Den enkle og praktiske løsning af den løsning, vi fandt, er dens virkelige styrke. Det er nemt at klone systemet og adoptere nye teknologier hurtigt." sagde prof. Goss.
For at demonstrere nytten af dets ultrapræcise feedback-enkeltmolekylemikroskop brugte forskerne det til at foretage direkte afstandsmålinger mellem signalproteiner i T-celler. En almindelig antagelse inden for cellulær immunologi er, at disse immunceller forbliver i ro, når T-cellereceptoren er tæt på et andet molekyle, der fungerer som en bremse.
Deres højpræcisionsmikroskopi var i stand til at vise, at de to signalmolekyler faktisk var yderligere adskilt fra hinanden i aktiverede T-celler, hvilket udløste bremsen og tændte for T-cellereceptorsignalering.
Prof. Goss sagde: "Konventionelle mikroskopiteknikker ville ikke være i stand til nøjagtigt at måle en så lille ændring, fordi afstanden mellem disse signalmolekyler i hvilende og aktiverede T-celler kun adskiller sig med 4-7 nanometer."
"Dette viser også, hvor følsomme disse signalmekanismer er over for rumlig isolation. For at identificere sådanne regulatoriske processer er vi nødt til at udføre præcise afstandsmålinger, hvilket er hvad dette mikroskop muliggør. Disse resultater illustrerer, at teknologien er under opdagelse og ikke kan fremstilles i nogen anden vej."
