Standardprocedure for kalibrering af polarisatorer i et polariserende mikroskop
Fluorescensmikroskop adskiller sig fra almindeligt optisk mikroskop ved, at det ikke observerer prøver under belysning af almindelige lyskilder. I stedet bruger den en vis bølgelængde af lys (normalt ultraviolet lys, blåt violet lys) til at excitere de fluorescerende stoffer inde i prøven under mikroskopet, hvilket får dem til at udsende fluorescens. Derfor er lyskildens rolle i fluorescensmikroskop ikke direkte belysning, men som en energikilde til at excitere de fluorescerende stoffer inde i prøven. Grunden til, at vi kan observere prøver, skyldes ikke belysningen af lyskilden, men fluorescensfænomenet udvist af de fluorescerende stoffer inde i prøven efter at have absorberet den exciterede lysenergi. Heraf kan det ses, at det karakteristiske ved fluorescensmikroskopi hovedsageligt er, at dens lyskilde kan levere en stor mængde excitationslys i et bestemt bølgelængdeområde, således at de fluorescerende stoffer i prøven kan opnå den nødvendige intensitet af excitationslys. Samtidig skal fluorescensmikroskoper have tilsvarende filtersystemer. Fluorescensmikroskop er et grundlæggende værktøj i fluorescensvævskemi. Den er sammensat af hovedkomponenter såsom en ultra-højspændingslyskilde, et filtersystem (inklusive excitations- og undertrykkelsesfilterplader), et optisk system og et fotografisystem. Den bruger lys af en bestemt bølgelængde til at excitere prøven og udsende fluorescens.
1. Metoder til fluorescensexcitation: Ifølge lysets bølgelængdeområde er der to typer: UV-excitationsmetode (ved hjælp af ultraviolet belysning) og BV-excitationsmetode (ved brug af blåviolet lys). UV-excitationsmetoden bruger nær ultraviolet lys kortere end 400nm til excitation. Denne metode har ikke synligt excitationslys, så den observerede fluorescens udviser farvestoffets iboende fluorescens, hvilket gør det let at skelne den specifikke fluorescens på prøven fra selvfluorescensen af baggrundsvævet.
2. BV excitationsmetode: Det involverer excitation fra ultraviolet til blåt lys centreret ved 404nm og 434nm. Denne metode bruger blåt lys til at bestråle prøven, så det afskårne-filter i fluorescensobservationssystemet skal bruge et filter, der fuldstændigt kan blokere blåt lys og helt passere gennem den påkrævede grønne og gule fluorescens. Fluorescerende pigmenter brugt til fluorescerende antistofmetode. Den maksimale absorptionsbølgelængde for excitationslys og den maksimale emissionsbølgelængde af fluorescens er relativt tæt på hinanden, så filteret, der bruges i BV-excitationsmetoden, skal bruge et skarpt skåret filter. Denne metode kan bruge blåt lys som excitationslys, så absorptionseffektiviteten af fluorescerende pigmenter er høj, og lysere billeder kan opnås. Ulempen er, at fluorescens under 500nm ikke kan ses, mens fluorescens over 500nm får hele billedet til at se gult ud. I den fluorescerende antistofmetode bestemmes specificiteten for det meste af farven, der er unik for fluorescerende pigmenter, så når man diskuterer subtil specificitet, har ulemperne ved BV-excitationsmetoden nævnt ovenfor ofte en betydelig indvirkning.
