Forskellen mellem positiv og negativ fasekontrast i et mikroskop
Afhængigt af konfigurationen og arten af faseringen placeret ved objektivets bagerste brændplan, kan prøver observeres i positiv eller negativ fasekontrast. Denne interaktive tutorial studerer forholdet mellem surround (S), diffraktion (D) og resulterende lyse partikler (P-bølger), samt positiv og negativ fasekontrastmikroskopi. Derudover præsenteres også fasepladens geometri og repræsentative prøvebilleder.
Når folk bruger det i deres arbejde nu, er de fleste af forskerne i den negative forskel, og nu spiller den positive forskel ikke den store rolle i det nuværende videnskabelige forskningsarbejde.
Selvstudiet initialiserer fasebilledet med en tilfældigt valgt prøve, der vises i vinduet Fasekontrastbillede, og det tilsvarende bølgeforhold vises i venstre nabo af billedvinduet. For at betjene øvelsen skal du bruge musemarkøren til at flytte oversættelsen mellem positiv og negativ fasekontrast eller skyderen til fasekontrasttilstand for lysende lys. Når skyderen er oversat, ændrer de billeder, der vises i fasekontrastbilledvinduet, hvordan prøven fremstår i den aktuelle billedbehandlingstilstand, der er indstillet af skyderen. Under kurvegrafen er der også en faseplade, der ændrer form for at matche billeddannelsestilstanden valgt af skyderen. For at se en ny prøve skal du bruge rullemenuen Valgt prøve til at vælge en anden prøve.
Et plot af fasepladekonfigurationen, bølgeforhold og vektorer forbundet med generering af positive og negative fasekontrastbilleder er vist i figur 1. Eksempler på prøver afbildet med disse teknikker er også vist. I en positiv fasekontrast optisk konfiguration (øverste række af billedet i figur 1), passerer surround (S)-bølgefronten gennem fasepladen, hvilket resulterer i en netto faseforskydning på 180 graders fasefremrykning med 1/4 bølgelængde ( 1 halv bølgelængde). Avancerede surround-bølgefronter er nu i stand til at deltage i destruktiv interferens med diffrakterede (D) bølger i det mellemliggende billedplan. I de fleste tilfælde er det ikke tilstrækkeligt alene at fremføre den relative fase af den omgivende bølgefront til at resultere i generering af højkontrastbilleder i Nikon-mikroskoper. Dette skyldes, at amplituden af surroundbølgerne er betydeligt større end de diffrakterede bølgers amplitude og undertrykker det resulterende billede, der produceres af interferens fra en brøkdel af det samlede antal bølger. For at reducere den omgivende bølgefront til en værdi tættere på amplituden af de diffrakterede bølger (og udføre interferens i billedplanet), opnås opaciteten i objektivets fasering ved at anvende et semi-transparent metal (neutral stigende tæthed) ) belægning Gulv. De omgivende lysbølger, som passerer næsten fuldstændigt gennem faseringen ved design, under fasekontrastmikroskopi, reduceres signifikant i amplitude af fasepladens opacitet til en værdi i intervallet 10 til 30 procent af den oprindelige intensitet.
Fordi den resulterende partikelbølge produceres af interferensen* af de omgivende og diffrakterede bølgefronter, er amplituden af partikelbølgen (P) produceret af interferensen mellem bølgefronterne, der ankommer til billedplanet, nu meget mindre end den omgivende, når den er i Sexual densitetsbelægning påført. Nettoeffekten er at konvertere den relative faseforskel, der indføres ved passage af lys, der kommer ud fra billedplanet gennem prøven, til en forskel i amplitude (intensitet). Fordi det menneskelige øje vil fortolke forskellen i intensitet som en kontrast, er prøven nu synlig i mikroskopokularet og kan også fanges på membranen med konventionelle kamerasystemer eller digitalt ved hjælp af CCD- eller CMOS-enheder. Alle positive fasekontrastsystemer fremmer selektivt fasen af den lineære surround (S)-bølgefront i forhold til den sfæriske diffrakterede (D) bølgefront. Prøver med et højere brydningsindeks end det omgivende medium ser mørkere ud på en neutral grå baggrund, mens dem med et lavere brydningsindeks end svømmemediet virker lysere end den grå baggrund.
For at modificere den rumlige adskillelse af de diffrakterede bølgefronter, der omgiver fasen og amplituden i et fasekontrastoptisk system, er der blevet indført en række fasepladekonfigurationer. Fordi fasepladen er placeret ved eller meget tæt på objektivets bageste brændplan (diffraktionsplan), skal alt lys, der passerer gennem mikroskopet, rejse gennem denne komponent. Den del af fasepladen i dens ringformede kondensatorfokus kaldes det konjugerede område, mens det resterende område kaldes det komplementære område. Det konjugerede område indeholder materialet, der er ansvarligt for at ændre fasen af det omgivende (udiffrakterede) lys med enten plus eller minus 90 grader i forhold til den diffrakterede bølgefront. Generelt er det fasekonjugerede ringareal bredere (ca. 25 procent) end området defineret af det kondenserende ringbillede for at reducere mængden af omgivende lys, der forplanter sig til det komplementære område.
De fleste faseplader, der er tilgængelige fra moderne mikroskopproducenter, er en af dem, der er fremstillet ved vakuumaflejring af tynde dielektriske og metalliske film på en glasplade eller monteret direkte på linseoverfladen af mikroskopobjektivet. Rollen af den dielektriske film er at fase lyset, mens metalfilmen dæmper intensiteten af det udbrudte lys. Nogle producenter bruger flere anti-reflekterende belægninger kombineret med filmen for at reducere mængden af blænding og refleksion af spredt lys tilbage i det optiske system. Hvis fasepladen ikke er dannet på overfladen af en linse, cementeres den sædvanligvis mellem på hinanden følgende linser, der befinder sig på brændplanet nær bagsiden af objektivet. Tykkelsen og brydningsindekset af de dielektriske, metal- og antirefleksbelægninger såvel som af den optiske cement er nøje udvalgt for at frembringe det ønskede faseskift mellem de komplementære og konjugerede områder af fasepladen. I optiske termer kaldes en faseplade, der ændrer fasen i forhold til det omgivende lys for at diffraktere lys med 90 grader (enten positiv eller negativ), en kvartbølgeplade på grund af den optiske vejforskeleffekt på den.
En oversigt over den positive fase inverse er vist i figur 1. Positiv fase kontrastpladen (venstre side af figur 1) driver surroundbølgen, med 1/4 bølgelængde, på grund af erosionsringen i glaspladen, som kan reduceres med det øvre gennemløb i højindekspladen. Bølgens fysiske vej. På grund af interaktion med prøven, når de diffrakterede prøvestråler (D) er retarderede, er den optiske vejforskel mellem de omsluttende og diffrakterede bølger, der kommer ud fra fasepladen, halv bølgelængde gange 1/4 bølgelængde. Nettoresultatet er en 180-graders optisk vejforskel mellem de omgivende og diffrakterede bølger, hvilket resulterer i destruktiv interferens for prøver med højt brydningsindeks mellem billedplanerne. Amplitudekurven for den positive fase modsat destruktive interferensbølge er vist i den øverste graf i figur 1. Den resulterende partikel (P) bølge har en lavere amplitude end surround (S)-bølgen, hvilket får objektet til at se ud sammenlignet med en relativt mørkere baggrund. Nederst, billede af Zygnema-grønalger vist til højre (mærket DL). Vektoren repræsenteret af fremskridtet af 1/4-bølgelængden, som er vist som en 90-grad mod uret roterende surroundbølge i positiv fasekontrast, vises mellem figuren og billedet i figur 1.
Alternativt kan mikroskopoptikken også fremstilles til at producere en negativ fase modsat, som vist i den nederste del af figur 1, i hvilket tilfælde surround (S)-bølgerne er forsinket (i stedet for som fremskreden) med en kvart bølgelængde i forhold til den ene diffrakterede (D) bølge. Som et resultat heraf fremstår prøver med høje brydningsindeks lysere mod en mørkere grå baggrund (se det nederste billede mærket BM i figur 1). I negativ fase modsat indeholder objektivfasepladen en hævet ring, der forsinker fasen (i stedet for at fremføre fasen som den modsatte positive fase), idet den passerer en kvart bølgelængde i forhold til fasen af den diffrakterede bølge som den nulte ordens surroundbølge. Fordi de diffrakterede bølger er blevet forsinket med en kvart bølgelængde, når de passerer gennem prøven, elimineres den optiske vejforskel mellem de omgivende og diffrakterede bølger, og prøven med højt brydningsindeks interfererer konstruktivt i billedplanet. Bemærk, at den resulterende partikel (P) bølge er højere i amplitude end surround (S) bølgen i negativ fasekontrast. Der er også vist en negativ faseomvendt, hvor omsejlingsbølgevektoren passerer gennem en 90 graders rotation med uret af vektordiagrammet.
