Fordele ved forbedringer til laserscanning af multifotonmikroskoper
Laser-scanning multifoton mikroskoper repræsenterer et stort fremskridt inden for optisk mikroskopi. De er hovedsageligt i stand til at observere dybe strukturer af levende celler, fikserede celler og væv og erhverve skarpe, klare flerlags Z-plan strukturer, nemlig optiske sektioner, som kan bruges til at rekonstruere den tredimensionelle faste struktur af prøver.
Et konfokalt mikroskop bruger en laserlyskilde. Den udvidede laserstråle fylder hele det bagerste brændplan af objektivlinsen og passerer derefter gennem objektivlinsesystemet for at konvergere til et ekstremt lille sted på prøvens brændplan. Afhængigt af objektivlinsens numeriske blænde er diameteren af det oplyste sted ca. 0,25-0,8 μm med en dybde på ca. 0,5-1,5 μm. Størrelsen af det konfokale punkt bestemmes af mikroskopdesign, laserbølgelængde, objektive karakteristika, scanningsenhedsparameterindstillinger og prøveegenskaber.
Widefield-mikroskoper har et stort belysningsområde og dyb belysningsdybde, mens belysningen af konfokale mikroskoper er koncentreret om et lille brændpunkt på brændplanet. Den grundlæggende fordel ved konfokale mikroskoper er, at de kan udføre fin optisk sektionering på tykke fluorescerende prøver (op til 50 μm eller tykkere), med snittykkelser fra 0,5 til 1,5 μm. En række optiske snitbilleder kan opnås ved at flytte prøven lodret via mikroskopets Z-akse stepmotor. Billedoptagelse er begrænset til det valgte plan og vil ikke blive forstyrret af signaler, der udsendes fra andre områder af prøven. Efter at have elimineret baggrundsfluorescens og forbedret signal-til-støj-forholdet udviser konfokale billeder markant højere kontrast og opløsning sammenlignet med konventionelle widefield-fluorescensbilleder.
I mange eksemplarer væver talrige indviklede strukturelle komponenter sig sammen for at danne komplekse systemer. Når der er opnået tilstrækkelige optiske snitbilleder, kan tredimensionel rekonstruktion udføres ved hjælp af software. Denne eksperimentelle metode er blevet anvendt bredt i biologisk forskning for at belyse de komplekse strukturelle og funktionelle forhold mellem celler eller væv.
