Sammenligning og funktioner af fluorescensmikroskop vs. almindeligt lysmikroskop
Fluorescensmikroskoper adskiller sig fra almindelige lysmikroskoper. I stedet for at observere prøver under belysning fra en konventionel lyskilde, bruger de lys med en specifik bølgelængde (normalt ultraviolet eller blåviolet lys) til at excitere fluorescerende stoffer i prøven på mikroskopet, hvilket får dem til at udsende fluorescens. Derfor tjener lyskilden i et fluorescensmikroskop ikke til direkte belysning; det fungerer som en energikilde til at excitere endogene fluorescerende stoffer i prøven. Vi er i stand til at observere prøven ikke på grund af belysning fra lyskilden, men på grund af fluorescensfænomenet, der opstår efter de fluorescerende stoffer i prøven absorberer excitationslysenergien.
Det følger heraf, at nøgleegenskaben ved et fluorescensmikroskop er, at dets lyskilde leverer rigeligt excitationslys inden for et specificeret bølgelængdeområde, således at fluorescerende stoffer i testprøven kan modtage excitationslys med tilstrækkelig intensitet. I mellemtiden skal et fluorescensmikroskop være udstyret med et passende filtersystem. Fluorescensmikroskopet er et vigtigt værktøj til fluorescenshistokemi. Den består af hovedkomponenter, herunder en ultrahøjtrykslyskilde, et filtersæt (inklusive excitations- og barrierefiltre), et optisk system og et fotografisk system. Det virker ved at ophidse prøver med lys af en vis bølgelængde for at inducere fluorescensemission.
Fluorescensexcitationsmetoder: Klassificeret efter bølgelængdeområde i to typer: UV-excitation (ultraviolet belysningsmetode) og BV-excitation (blå-violet lysmetode). UV-excitationsmetoden bruger nær-ultraviolet lys kortere end 400 nm til excitation. Der er intet synligt excitationslys til stede med denne metode. Følgelig viser den observerede fluorescens farvestoffets iboende fluorescens, hvilket gør det let at skelne specifik fluorescens på prøven fra autofluorescens af baggrundsvævet.
BV excitationsmetode: Excitation udføres ved hjælp af lys, der spænder fra ultraviolet til blåt, centreret ved 404 nm og 434 nm. Da denne metode bestråler prøven med blåt lys, skal afskæringsfilteret i fluorescensobservationssystemet fuldstændigt blokere blåt lys, mens det i tilstrækkelig grad transmitterer den nødvendige grønne og gule fluorescens. Det anvendes på fluorokromer, der anvendes i fluorescerende antistofanalyser. Den maksimale absorptionsbølgelængde af excitationslyset er relativt tæt på den maksimale emissionsbølgelængde for fluorescens, så skarpskårne filtre er obligatoriske til BV-excitationsmetoden. Blåt lys kan bruges som excitationslys i denne tilgang, hvilket giver høj absorptionseffektivitet af fluorokromer og relativt lyse billeder. Dens ulempe er, at fluorescens under 500 nm ikke kan detekteres, mens signaler over 500 nm gør hele billedet gult. I fluorescerende antistofassays bedømmes specificitet for det meste ud fra den karakteristiske farve af fluorochromer. Derfor, når subtil specificitet er under evaluering, udøver ulemperne ved BV-excitationsmetoden ofte en betydelig negativ indvirkning.
