Tekniske karakteristika og brugsfærdigheder af to-foton fluorescensmikroskop
To-foton fluorescensmikroskopi er en ny teknologi, der kombinerer laserscanning konfokal mikroskopi og to-foton excitationsteknologi.
Grundprincippet for to-foton excitation er: i tilfælde af høj fotondensitet kan fluorescerende molekyler absorbere to langbølgede fotoner på samme tid og udsende en kortere bølgelængde foton efter en kort periode med såkaldt exciteret tilstandslevetid . ; Effekten er den samme som at bruge en foton med en bølgelængde, der er halvdelen af den lange bølgelængde til at excitere et fluorescerende molekyle. To-foton excitation kræver en høj foton tæthed. For ikke at beskadige celler, bruger to-foton mikroskopi højenergi mode-låste pulserende lasere. Laseren, der udsendes af denne laser, har høj spidsenergi og lav gennemsnitsenergi, dens pulsbredde er kun 100 femtosekunder, og dens periode kan nå 80 til 100 megahertz. Når du bruger en objektivlinse med høj numerisk blænde til at fokusere fotonerne i den pulserende laser, er fotondensiteten ved objektivlinsens brændpunkt den højeste, og to-foton-excitationen sker kun ved objektivlinsens brændpunkt, så to-foton-mikroskopet behøver ikke et konfokalt nålehul, hvilket forbedrer effektiviteten af fluorescensdetektion. Det er en vigtig forskningsmetode inden for morfologi, molekylær cellebiologi, neurovidenskab og farmakologi.
1. Baggrunden for fremkomsten af to-foton mikroskopi - to begrænsninger af traditionel laser konfokal mikroskopi:
1) Det ene er fototoksicitetsfænomenet: fordi det konfokale nålehul skal være lille nok til at opnå et billede i høj opløsning, og den lille blænde vil blokere en stor del af den fluorescens, der udsendes fra prøven, inklusive fluorescensen, der udsendes fra fokalplanet, det tilsvarende Ja, excitationslyset skal være stærkt nok til at opnå et tilstrækkeligt signal-til-støj-forhold; og laseren med høj intensitet vil få det fluorescerende farvestof til at falme hurtigt under kontinuerlig scanning, og det fluorescerende signal vil blive svagere og svagere, efterhånden som scanningen skrider frem.
2) Fototoksicitet er et andet problem. Under laserbestråling vil mange fluorescerende farvestofmolekyler producere cytotoksiner såsom singlet oxygen eller frie radikaler, så scanningstiden og den optiske effekttæthed af excitationslyset bør begrænses i eksperimentet for at opretholde prøvedensiteten. aktiv. I forskningen i aktive prøver, især de forskellige stadier af vækst og udvikling af aktive prøver, gør fotoblegning og fototoksicitet disse undersøgelser meget begrænsede.
2. Hvorfor siger du, at to-fotonmikroskoper generelt ikke behøver at være udstyret med ultraviolette excitationslasere?
To-fotonmikroskopi er en fluorescens-excitationsteknologi baseret på to-foton-excitationseffekten: fluorescerende farvestofmolekyler kan exciteres ved at absorbere to lavenergifotoner på samme tid (tidsintervallet mellem to fotoner, der når fluorescerende molekyler er mindre end 1 femtosekund ), kan dens excitationseffekt svare til at absorbere en højenergifoton på 1/2 bølgelængde. For eksempel, at absorbere to fotoner ved røde bølgelængder svarer til et molekyle, der absorberer ultraviolet. Langbølgede fotoner absorberes ikke let af celler, så fototoksicitet for levende celler reduceres, og fotoblegning reduceres også. På denne måde spiller den ikke kun funktionen af ultraviolet excitation, men undgår også skaden af ultraviolet lys på prøven.
3. Hvad er specielt ved laseren i to-fotonmikroskop?
Sandsynligheden for absorption af to fotoner afhænger af, hvor tæt de to indfaldende fotoner falder sammen i rum og tid (de to fotoner skal ankomme inden for 10-18 sekunder). To-foton-absorptionstværsnittet er lille, og kun fluoroforer i områder med en stor fotonflux exciteres. Derfor er de fleste af de anvendte lasere titanium safir lasere, som kan opnå picosekund eller femtosekund scanningshastigheder, og har meget høj spidseffekt og lav gennemsnitseffekt, så fotoblegning og fototoksicitet kan reduceres eller elimineres. Det vigtigste er at give en meget høj tæthed af fotoner i et lille område, som kan sikre samtidig excitation af to fotoner.
4. Hvad er fordelene ved to-foton excitation?
1) Forøg farvestoffets selektivitet: excitationslysområdet for den konfokale systemlaser (Ar, Ar/Kr, HeNe) er 488nm - 647nm. Dette betyder at eksperimentere med UV-exciterede fluorescerende farvestoffer, f.eks. med DAPI, Hoescht. Excitationsbølgelængden af to-foton er det dobbelte af en enkelt foton, så farvestoffer exciteret af ultraviolet kan exciteres af nær-infrarødt lys.
2) Reducer fotoblegning: På grund af reduktionen i fotoblegning øges succesraten for eksperimenter med CFP/YFP til fluorescensresonansenergioverførsel (FRET).
3) Der kræves ingen speciel objektivlinse: Fra hardwaresynspunktet kræver exciteringen af UV-exciterede farvestoffer med bølgelængden af nær-infrarødt lys ikke specielle UV-optiske komponenter.
4) Forbedre signal-til-støj-forholdet: excitationslysbølgelængden og den udsendte lysbølgelængde har en stor forskel, hvilket forbedrer signal-til-støjforholdet.
5) Blegning lokaliseret til brændpunktet: Da fluorescensexcitation kun forekommer ved objektivets brændpunkt, er der ikke behov for et konfokalt nålehul. Dette forbedrer lysdetektion, og fotoblegning forekommer kun i brændpunktet.
6) Nemmere at trænge ind i prøver: Infrarødt bølgelængdelys spredes ikke let af celler og kan trænge ind i dybere prøver.
5. Sammenlignet med laserscanning konfokal mikroskopi, hvad er den største forbedring foretaget af to-foton mikroskopi?
1) Reduceret fotoblegning.
2) Reduceret fototoksicitet.
3) Det er ikke nemt at sprede, og det er lettere at trænge igennem tykke prøver, såsom hjerneskiver.
